eNOS/F92A-Caveolin-1基因修饰内皮祖细胞治疗肺动脉高压的分子机制

Caveolin-1 is a key factor that regulated endothelial nitric oxide synthase (eNOS). Abnormal expression of Caveolin-1 can promote Caveolin-1 binding to eNOS. The activity of eNOS is reduced when binding with Caveolin-1, which resulted in reduced nitric oxide production and decreased vessel wall compliance. Within the Caveolin-1 a particular phenylalanine 92 has been shown to be primarily responsible for this inhibitory effect by binding to eNOS. Replacement of the phenyalanine with alanine (F92A) named F92A-Caveolin-1 has no inhibitory effect on eNOS. As there is no report for using stem cell modified with F92A-Caveolin-1 to treat pulmonary arterial hypertension (PAH). Therefore, in this application we propose a novel cell based strategy for treatment of PAH in the monocrotoline rat model using endothelial progenitor cells genetically modified to express either eNOS or the mutant F92A-Caveolin-1 alone or in combination, to increase eNOS activity, regulate vasomotor imbalance in PAH, promote pulmonary vascular repair and angiogenesis, to reveal the molecular mechanism for treatment of PAH.

窖蛋白-1(Caveolin-1)是调节内皮型一氧化氮合成酶（eNOS）的关键性因子，Caveolin-1的异常表达可促进eNOS和Caveolin-1的结合，结合型eNOS活性降低，导致一氧化氮合成减少，血管壁顺应性减低。与eNOS结合发挥抑制效应的主要是Caveolin-1结构中位于92位的苯丙氨酸。用丙氨酸(F92A)代替苯丙氨酸所得的突变型F92A-Caveolin-1对eNOS无抑制作用。目前，用突变F92A-Caveolin-1 修饰的干细胞治疗肺动脉高压（PAH）未有报道。因此，本课题采用单独或联合表达eNOS, F92A-Caveolin-1基因修饰的内皮祖细胞移植入野百合碱诱导的大鼠PAH模型的细胞疗法，以增加eNOS的活性，调节PAH时血管舒缩之间的失衡，促进肺血管修复及新生血管的形成，并揭示其治疗PAH的分子机制。

本项目阐明了对内皮型一氧化氮合酶（eNOS）无抑制作用的突变型Caveolin-1（F92A-Cav1），可促进扩血管因子一氧化氮（NO）释放；揭示F92A-Cav1修饰的干细胞移植入野百合碱（MCT）诱导的肺动脉高压（PAH）大鼠，对PAH的治疗作用及机制。主要取得以下成果：（1）在干细胞的选择上，揭示了大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）具有较好的稳定性与一致性；明确了F92A-Cav1及/eNOS/F92-Cav1修饰的rBMSCs可有效上调eNOS表达，促进NO释放及新生血管的形成，且增加的NO无明显细胞毒性作用；（2）体内研究阐明了基因修饰的rBMSCs移植后定植于肺组织；采用rBMSCs/eNOS/F92-Cav1治疗的PAH大鼠，其肺血流动力学、右心室肥大指数、肺小动脉中膜厚度、大鼠一般状态指征、大体肺组织病理学、肺组织超微结构及大鼠存活率等均获得改善；（3）揭示了采用丙氨酸替代92位苯丙氨酸获得的突变型F92A-Cav1除不具有抑制eNOS活性外，对其它信号通路均有调控作用。F92A-Cav1可竞争性改变Cav1的信号调控作用，促进eNOS活性并下调PI3K/Akt通路及Raf-MEK/ERK通路，抑制细胞增殖与纤维化相关基因c-Myc, Bcl2a1d, Notch1，Hey2，Ppard、Dab2、ROCK及病理性血管生成相关基因Lrg1的表达，降低Myocardin表达进而抑制血管内皮细胞向平滑肌细胞的转换，抑制缩血管因子ET-1的表达；（4）其它新发现，① F92-Cav1可激活转录因子Kruppel-like factor 4 (KLF4)-P53通路，促进p53下游的靶基因Cdkn1a，Bbc3与Btg2的表达，阻止PAH大鼠平滑肌细胞的增殖与纤维化；②上调的KLF4可发挥其炎症抑制作用，改善肺组织炎症，缓解肺组织氧化应激反应，抑制炎性因子TNF-alpha, Icam1, C/EBPdelta及氧化应激基因Hmox1的表达。上述研究表明移植F92-Cav1修饰的干细胞一方面可解决受损肺组织的修复，另一方面有效抑制肺血管平滑肌细胞增殖/纤维化、抑制炎症、改善肺血管舒张功能障碍等病理变化，达到治疗肺动脉高压的作用。本项目发表SCI论文7篇，国内论文1篇，在F92-Cav1的信号调节功能及对PAH的治疗方面的研究取得特色鲜明的研究成果。