基因异质性在乳腺癌转移和化疗中的作用

Breast cancer is known to be a heterogeneous disease. Genetic heterogeneity plays an important role in tumor metastasis and resistance to chemotherapy. In our previous work, we detected 30 genes copy number variations (CNVs) in the breast cancers with different differentiation using QM-FISH (Qantitative Multicolour Fluorescent In Situ Hybridization) which allows the quantitative determination of genes in each individual cell nucleus, and thus enables the analysis of genetic changes in relation to intro-tumor heterogeneity. By the comparison of the biomarkers status changes prior to and after neoadjuvant chemotherapy (NAC), we found different chemo-response in tumors with clonal variations. Our previous work suggests that it is of great value to explore a prospective procedure for genetically heterogeneous breast cancer patients. In the current project, we will focus on detailed analysis of genetic variation within multiple samples from the same patient, including specimens from primary loci and metastatic loci, NAC samples prior to and after chemotherapy. Using QM-FISH technical approaches, we will search for features predicting metastasis and to identify specific genetic signatures relating to chemotherapy response. Completion of this project will help to predict the risk of metastasis and provide reasonable strategies for breast cancer patients with intro-tumor heterogeneity.

乳腺癌是一种高度异质性的肿瘤，基因异质性在乳腺癌转移及化疗抵抗中发挥重要作用。申请人前期参与研究的高分辨率定量多色荧光原位杂交技术（QM-FISH），能精确区分不同肿瘤细胞克隆，检测同一肿瘤细胞内30种以上基因的拷贝数变异(CNVs)。我们前期通过对新辅助化疗标本的研究，发现异质性肿瘤细胞克隆在化疗反应方面存在明显差异。初步研究结果提示我们有必要对肿瘤克隆性基因差异表达进行更加细致、深入的研究，开发一种前瞻性分子诊断程序，用于复杂类型乳腺癌患者的精细化分子病理诊断。本项目将从病理形态、蛋白受体表达及基因CNVs异质性的不同层面入手，比较乳腺癌原发灶和转移灶肿瘤细胞的异质性变化，利用计算机软件辅助分析，从复杂多变的分子事件中获取与转移相关的关键基因变化；追踪基因异质性肿瘤克隆在化疗过程中的分子变化，以及对化疗药物的反应性差异，探寻与化疗抵抗相关的基因变化，为临床化疗方案的制定提供理论指导。

目前在肿瘤治疗的研究中，CHK1靶向抑制剂的治疗效果已被证实，主要是在联合化疗中的作用，也有部分报道指出CHK1靶向抑制剂的单剂抗肿瘤活性。但在乳腺癌中，因受限于明显的肿瘤异质性，CHK1靶向干预的作用机制与应用方式依然不明。首先我们利用TCGA数据库评估了CHK1的表达模式，并使用Kaplan Meier Plotter在乳腺癌患者中针对CHK1进行了生存分析。在乳腺癌细胞中，分别转染针对CHK1的siRNA、CHK1及其激酶突变体（CHK1-S317A/S345A）的重组质粒与相应的对照，进行了细胞功能试验，包括增殖（CCK8、EdU、克隆形成实验）、药物敏感性检测以及细胞周期和凋亡的检测。在机制研究中，我们进行了基因数据集与表型数据集的联合转录组分析，并进一步通过表观调控筛选实验，RT-qPCR和western blot来验证。TCGA与Kaplan Meier Plotter的乳腺癌大样本病例数据表明，CHK1的表达与生存分析均与ER和PR存在密切的关系。我们的实验结果表明，在ER-/PR-/HER2-乳腺癌中，靶向抑制CHK1可作为阿霉素的致敏剂，而在ER+/PR+/HER2-细胞中，靶向抑制CHK1却变成了肿瘤细胞的独立损伤因子而非化疗致敏剂。在机制研究中，我们发现，在ER-/PR-/HER2-乳腺癌中，CHK1可被阿霉素诱导激活，并通过MCC-APC/C-cyclinB1轴介导的细胞周期调控与MSX和Bim介导的凋亡调控，来影响阿霉素对肿瘤细胞的杀伤力。与之不同的是，在ER+/PR+/HER2-乳腺癌中，因CENPF介导的CHK1转录激活被阿霉素强烈抑制，使得CHK1无法参与阿霉素引起的损伤应激反应，因此CHK1的靶向抑制无法发挥化疗致敏效应。虽然如此，但有意思的是，在ER+/PR+/HER2-乳腺癌中，CHK1凭借下游分子p21、Eg5与Fas的作用成为维持肿瘤细胞生存的必须分子，从而仅靠单一的靶向抑制CHK1就能造成ER+/PR+/HER2-肿瘤细胞明显的周期阻滞与凋亡激活的效应。以上发现表明，在乳腺癌中，CHK1的作用会因ER/PR的状态不同而发生转变，而这也就为 CHK1靶向抑制剂在乳腺癌治疗中的应用提供可靠了的决策依据，因此，准确定位CHK1在不同ER/PR状态下的作用，是合理靶向用药的关键。