有氧运动诱导Isl1+心肌祖细胞自我更新与分化的谱系示踪研究

Cardiomyocytes in adult mammals retain a limited ability to proliferate in response to specific stimuli, such as aerobic exercise, but little is known about the molecular mechanism and the origin of proliferating cells. Using conditional genetic marking techniques, we will perform tamoxifen-inducible Cre/loxp-triggered cell lineage tracing experiments to irreversibly mark the LIM-homeodomain transcription factor islet-1(Isl1)-expressing cells as well as their differentiated progeny. Application of tamoxifen to double heterozygous Isl1-Cre+/Rosa26-EGFP+ mice before aerobic exercise training will achieve temporal and spatial control of Cre expression required for tracing the fate of Isl1+ progenitors. Moreover, the Isl1 cardiac cell lines would be expanded in vitro culture using fluorescence-activated cell sorting (FACS) after labelling with EGFP to study cardiac cell lineage differentiation and exercise-induced cardiomyocyte proliferation.The study is important for understanding and treating cardiovascular diseases，and will be useful to provide the experimental foundation and theoretical warrant for biology, clinical medicine and sports rehabilitation medicine.

针对有氧运动促进心肌细胞增殖的分子机制不清，增殖细胞来源不明等问题，本研究采用Tamoxifen诱导的Cre-loxP条件性遗传标记技术，不可逆地对Isl1+心肌祖细胞及其后代进行细胞遗传谱系示踪，观察有氧运动训练是否促进小鼠心脏组织中Isl1+心肌祖细胞的分裂和向心肌细胞分化。通过组织病理分析、原代细胞分离及培养、分子表达研究等手段，从分子、细胞与形态三个层面研究有氧运动诱导Isl1+心肌祖细胞的更新频率、分化效率和心脏发育再生行为。本研究体现了多学科交叉融合的科学发展思想，研究结果将有助于验证或补充运动促进成体心肌细胞自我更新和分化的影响及机制，对预防医学和康复医学具有特殊意义，为生物学、临床医学和运动医学提供有价值的研究基础和实践依据。

本研究主要针对成体心脏心肌细胞增殖的分子机制不清，增殖细胞来源不明等问题，采用最新基因组编辑技术CRISPR/Cas9系统构建CreERT2定点敲入Isl1基因小鼠，结合Cre/loxP系统，与Rosa26-LacZ小鼠交配，获得Isl1-CreERT/ Rosa26-LacZ双杂合小鼠，不可逆地对Isl1阳性细胞及其后代进行细胞谱系识别和示踪，研究Isl1阳性细胞在小鼠胚胎期、正常生理状态下和运动诱导下成体心脏中的作用，从分子、细胞与形态三个层面研究心脏的发育再生行为。.1、建立Isl1谱系示踪小鼠模型。采用最新基因编辑技术CRISPR/Cas9系统，构建CreERT2定点敲入Isl1基因小鼠模型。经过基因组鉴定、表达谱测定、X-gal整染、组织切片和免疫荧光等方法，确认在Isl1基因启动子后定点敲入了CreERT2基因，成功建立谱系示踪小鼠模型。.2、正常生理状态下Isl1阳性细胞在成体小鼠心脏中的特性。选取阳性2月龄模型雄鼠，tamoxifen诱导后1、8和24周取材。结果正常生理条件下，Isl1阳性细胞仅分布在窦房结、神经节、主动脉和肺动脉根部等位置，位置和数量随着时间推移没有显著变化，即正常生理状态下的成体小鼠心脏中没有进行增殖和分化。.3、运动刺激对Isl1阳性细胞在小鼠成体心脏中的增殖诱导。构建有氧运动和超负荷运动模型进行干预。心超、体重指数、血液指标、组织切片和Ki67免疫荧光等显示：运动组Cyclin-D与安静组相比，表达有显著性提高，且运动促进成体小鼠心肌细胞增殖，但增殖的细胞不是Isl1阳性细胞。.4、Isl1阳性细胞在小鼠胚胎发育期特性。在E7.5和E9.5对孕鼠进行tamoxifen诱导。胚胎发育早期（E7.5）Isl1阳性细胞贡献了心脏发育所需的左心房、右心房、右心室、部分左心室和流出道等部位细胞，具有祖细胞特性。胚胎发育后期（E9.5）Isl1表达量下降，Isl1阳性细胞仅分布在流出道等部位。.结论：Isl1阳性细胞在正常生理状态和运动诱导下的成体小鼠心脏中不具备祖细胞特性，在小鼠胚胎早期（E7.5）具有祖细胞特性；在胚胎发育后期（E9.5）已逐渐失去祖细胞特性。.研究中新发现，Isl1基因表达的剂量差异影响了运动诱导后心脏的形态和功能，具体机制需在后续研究中进一步探讨。