Notch信号通路在胎肝干/祖细胞自我更新和分化中的调控作用及其分子机制研究

细胞治疗是急、慢性终末期肝病最有前景的疗法，胎肝干/祖细胞（FLSPCs）因高存活、高增殖、小体积和高安全优势，成为干细胞治疗肝病的理想细胞之一。本课题组应用三步分离法富集FLSPCs，获得了与流式分选近似的分离效率，并在大鼠急性肝衰竭模型中，证实FLSPCs能参与肝脏形态和功能的恢复。然而，要探索FLSPCs治疗潜能，以下两个问题急待解决：首先，如何保持FLSPCs自我更新；其次，如何促进FLSPCs准确分化为肝细胞和胆管细胞。鉴于Notch信号在诸多干细胞更新和分化中的关键调节作用，以及本课题组发现Notch信号在FLSPCs分化较更新时下调、Notch信号在肝再生过程中调控细胞增殖和分化，我们提出：Notch信号可能参与FLSPCs的自我更新和分化的调控。本课题拟开展Notch信号对FLSPCs命运的调控效应和相关分子机制的研究，发现相应的干预靶点，为FLSPCs的临床应用提供依据。

细胞治疗是急、慢性终末期肝病最有前景的疗法，胎肝干/祖细胞（FLSPCs）因诸多优势，成为治疗肝病的理想细胞之一。然而，将其用于临床还需提供稳定的干细胞来源，并能定向分化为所需细胞用于治疗。我们在建立“三部分离法”提取大鼠FLSPCs基础上，改良并成功建立小鼠EGFP-FLSPCs提取方法，拓宽了细胞来源，且具有很好的示踪效果；利用软琼脂立体培养，优化了获取细胞的体外增殖；通过筛选，建立了最优的体外定向诱导FLSPCs向肝细胞的分化方案，并在不同急性肝损模型中探讨了FLSPCs的治疗效果，有效推动了FLSPCs临床治疗研究的进展。同时，课题组发现Notch信号通路在FLSPCs 分化较更新时下调、在肝再生过程中调控细胞增殖和分化。通过检测F344大鼠不同时期肝细胞Notch各组件的表达，我们发现其中Notch3随发育过程发生了最大程度的下调。比对阻断Notch和诱导化过程，发现Notch3下降同时，成熟细胞标志ALB、CYP450、CK8上升，不成熟细胞标志AFP下降；胆管细胞标志CK7、CK19下降，且伴随干细胞标志CD133出现一致性下调。由此，我们首先提出Notch3不但参与FLSPCs向肝细胞的分化过程，更是FLSPCs的一个潜在标志物。进一步，我们研究了FLSPCs分化过程中Notch与HGF、HNF的相互关系，发现抑制Notch信号通路后，HGF、HNF-4α表达无显著差异，但HNF-1β明显下调；作为胆管细胞分化的关键因素，敲除HNF-1β后，HNF-4α无显著变化，但FLSPCs的G6P、CYP450表达升高，AFP表达下降，CK19和CK7表达下降，表达低密度脂蛋白，趋向分化为具有一定肝细胞功能的细胞，其效率与诱导分化相当；随HNF-1β抑制，肝细胞特异表达的claudin-1表达，而非特异的claudin-4则不表达。通过以上研究，我们首次提出Notch不是直接通过上调HGF或HNF-4α促进FLSPCs向肝细胞分化，而是通过抑制HNF-1β从而抑制向胆管细胞分化，间接促使肝细胞分化。通过本课题的开展，为FLSPCs的来源与应用问题提供了良好的解决方案，深入了对Notch决定FLSPCs命运相关机制的研究，更为将来FLSPCs用于临床治疗奠定了坚实基础。