治疗性血管再生在脑白质疏松症基因疗法中的实验研究

脑白质疏松症(LA)与高血压、糖尿病、老龄密切相关，随人口老龄化加剧，发生率增加，作为认知功能障碍、痴呆、卒中的预知因素，对其进行基础研究尤为重要。目前国内外对LA发生机制已有共识，但对其早期干预治疗研究甚少。本项目在前期对LA及嗅鞘细胞(OECs)的研究基础上，将血管内皮生长因子（VEGF）基因扩增后，酶切插入真核表达载体pcDNA3.1(+)，质粒DNA序列分析筛选，转染促进轴突再生和髓鞘修复的鼻腔黏膜OECs，构建OECs-VEGF基因工程细胞，移植入LA大鼠侧脑室不同部位，观察局部血管的超微结构、定量评价微血管密度；分析基因工程细胞在脑内迁徒、分化、融合特点；研究VEGF基因的调控表达、血管再生、髓鞘重建；探讨VEGF基因修饰的鼻腔黏膜OECs对LA的治疗作用。为临床开展OECs自体移植、解决移植后VEGF表达量较少、持续性欠佳等瓶颈问题，探索出一条基因治疗LA的突破性方法。

内容：1.LA的弥散张量成像及与认知功能的相关性研究；2.LA模型的建立；3.基质金属蛋白酶和TLR-4，MCP-1，VCAM-1炎性介质在LA血脑屏障机制的作用；4.嗅鞘细胞（OECs）的分离、培养、纯化与鉴定；构建携带VEGF165基因的慢病毒；VEGF165-慢病毒载体转染OECs，构建OECs-VEGF165 基因工程细胞及分泌的VEGF165活性检测；5.注射基因工程细胞后LA模型的行为学检测、髓鞘碱性蛋白(MBP)的表达。.结果：1.DTI技术能够发现脑白质微结构改变，DCavg、FA值在老年人LA显示特征性改变，并与认知功能存在相关性。DTI技术可判断脑白质疾病的严重程度，同时可探索LA认知障碍的发生机制。2.成功建立LA模型，老龄高血压大鼠模型较为适合，磁共振检查、病理观察和免疫组化检测证实其可靠性。3. 实验组LA大鼠脑白质区TIMP-1、MMP-9、MMP-2的mRNA表达水平升高，其中TIMP-1与MMP-2的mRNA升高显著（P＜0.05）。脑白质TLR-4，MCP-1和VCAM-1的mRNA表达显著增高（P＜0.05），其水平越高，脑白质损伤程度也越重。MMPs导致的血脑屏障破坏，炎症反应参与LA的病理生理过程，血脑屏障损伤可能是脑白质疏松症的发病机制之一。 4.利用改良的差速贴壁法使分离、纯化的OECs原代细胞达98%，是简便、经济的方法；随着原代细胞传代次数的增加，OECs的纯度和活性明显下降，故要选择第一、二代细胞；携带有human-VEGF165基因的慢病毒载体可以成功将目的基因转入OECs，并达到＞80%的转染效率；通过携带有human-VEGF165基因的慢病毒载体感染OECs，构建出的human-VEGF-OECs基因工程细胞可稳定、高效表达VEGF165基因，合成的目的蛋白分泌到细胞外，符合VEGF165蛋白的生理特点。5. 注射基因工程细胞后LA模型的大鼠空间学习和记忆能力明显提高，其中14天和35天较模型组有显著性差异(P＜0.01)，但未达到正常组水平。免疫组化显示MBP阳性表达提高。.科学意义：成功建立了LA模型，发现血脑屏障损害是LA的发病机制之一，构建的VEGF-OECs基因工程细胞能稳定高效表达VEGF165基因，治疗后的LA模型认知功能提高，这些成果在国内外鲜有报道，有较高的学术价值和广阔的应用前景。