治疗性iLRP单克隆抗体的抗原表位研究

Monoclonal antibodies, ZMC01Ab and ZMC02Ab against immature laminin receptor protein (iLRP), which were developed in our lab, showed strong tumor cell killing. Accordingly, we believe that they might be used as candidates for drug developing in tumor immunotherapy as iLRP is also a tumor specific antigen playing a very important role in tumor growth, progression and metastasis. However, there is a mature form mLRP (mature laminin receptor protein) existing in normal tissues, which is a dimer formed from iLRP. Theoretically, it is possible for antibodies targeting at iLRP to cross react with mLRP. To test if this happens to ZMC01Ab and ZMC02Ab, we did Western Blotting and found out that they only bound to iLRP specifically, but not to mLRP. In order to elucidate the mechanism, we propose to characterize antigenic epitopes to these antibodies through the technique of peptide scanning, then to analyze the importance of these epitopes in the 3D structure and functions according to the structural and functional known information from iLRP. The study will have far reaching impact on developing therapeutical drugs targeting at iLRP.

自主研发的抗iLRP(immature laminin receptor protein)单克隆抗体ZMC01Ab和ZMC02Ab在体外实验中显示了很强的瘤细胞杀伤活性，又因为iLRP是肿瘤特异性抗原，与肿瘤发生、生长和转移等息息相关，因此，我们认为ZMC01Ab和ZMC02Ab可以作为靶向iLRP的治疗性抗体来研究。然而，由于正常组织中存在iLRP二聚体化后的成熟形式mLRP (mature laminin receptor protein) ，上述抗体很有可能与之发生交叉反应而对正常组织造成伤害。为此，我们通过Western Blotting对抗体的特异性做了研究，发现它们只特异性结合iLRP，而不与mLRP特异结合。本项目将通过肽扫描技术对抗体的抗原表位进行鉴定，并结合iLRP和mLRP的结构功能信息，分析抗原表位在蛋白质结构和功能中所起的作用，从而阐明这一现象的机理。

项目前期获得了两个抗iLRP (immature laminin receptor protein)的单克隆抗体，且具有强烈的瘤细胞杀伤活性，加之肿瘤抗原iLRP是非常理想的肿瘤免疫治疗靶点，因此以iLRP为靶点的肿瘤免疫治疗是非常具有吸引力的。本项目从各方面对这两个抗体进行了细致研究以后，选出其中一个更具有价值的抗体ZMU-Ab(即项目计划书中的ZMC01Ab)做了抗原表位鉴定，并成功将其定位在iLRP N端第20-50氨基酸序列的范围。根据这一结果，成功解释了ZMU-Ab不与mLRP (mature laminin receptor protein)发生交叉反应的现象。根据已有文献报导，iLRP的C端位于细胞膜的外表面，N端位于细胞膜的内表面，并通过某一至今未明的区段使iLRP跨膜表达于细胞膜上。这样，ZMU-Ab理应不会与完整瘤细胞的外表面结合。但我们的结果显示，ZMU-Ab完全可以结合于瘤细胞膜外表面，因此我们推断， iLRP N端与C端共同表达于瘤细胞膜的外表面，并且通过某一个特殊化学基团锚定在细胞膜上。由于已有文献表明，iLRP的生物学功能区域主要位于其C端，其N端主要是与另一未知的蛋白成分发生作用形成成熟形式的mLRP (mature laminin receptor protein)，这样，其N端在mLRP中结构上会发生巨大改变甚至被完全遮盖，以至于不被抗N端的抗体所识别，而C端由于要及时行驶各种生物学功能，要求具有相对独立的结构，因此，即使在mLRP的形式中，能够识别单体iLRP C端的抗体也容易与之结合，从而产生交叉反应现象。这样，抗N端抗体在靶向iLRP的免疫治疗中就具有很明显的优势，大大降低副作用带来的风险。基于此，在项目实施的后期，我们对抗体ZMUAb进行了DNA序列测定，构建和表达了相应的单链抗体，在充分验证后希望在CAR-T治疗领域继续以iLRP为靶点进行研究。同时，我们还构建了iLRP的真核表达载体，通过在肿瘤细胞中高表达iLRP的方法研究全细胞肿瘤疫苗在免疫治疗中的可能性。