甜菜NiR(EC 1.7.7.1)基因的克隆、特性及其与NR的偶联调节

运用同源序列和RACE技术克隆甜菜NiR基因，将其编码的氨基酸序列与纯化的NiR蛋白N端氨基酸序列比对，证实克隆的为NiR基因。属首次克隆甜菜NiR基因与纯化NiR酶，可为种质资源鉴定、氮高效利用的基因操作提供理论依据。.采用荧光定量PCR法和蛋白二维电泳分析技术，探讨氮素形态数量、逆境胁迫因子对NiRmRNA、NiR蛋白的调控，进行NiR的基因-蛋白-活性水平的特性研究。在作物栽培、营养生理和分子生物学交叉点上获取新知识，填补基础性资料，可打破当前酶基因克隆与活力调节孤立研究的局面，对丰富作物科学理论有很大的学术价值。.设计抑促NR/NiR的交叉试验，研究NiR与NR的偶联调节及其与甜菜蔗糖代谢的相互关系，可打破当前氮素无机同化研究偏重于NR的不平衡局面，为制定甜菜丰产高糖施肥措施服务，提高氮素同化和利用效率。对防止施肥中硝酸盐对地下水的严重污染具有重要生态意义，应用前景十分广阔。

按照研究计划借助现代分子生物学手段，通过RACE方法，首次克隆甜菜亚硝酸还原酶（NiR）编码基因的cDNA全长序列以及基因组gDNA全长序列；分析确定了甜菜亚硝酸还原酶基因编码蛋白的多肽序列和功能区域；推测出甜菜亚硝酸还原酶蛋白的3D结构；并通过实时荧光定量PCR的方法（RT-PCR）, 在转录水平上明确了该基因在NO3--N和NH4+-N两种形态氮素的不同比例及不同浓度条件下的表达变化，揭示氮素条件和甜菜NiR基因表达的关系；在氮素诱导的基础上，进一步研究不同浓度蛋白抑制剂放线菌酮和环境因子NO2-和NaCl对亚硝酸还原酶基因表达的影响；在甜菜全生育期，同步测定NR与NiR活性，二者的动态变化一致，明确了NiR与NR的偶联调节机制及其与甜菜蔗糖积累的关系；建立了调节NR、NiR最适活性、叶绿素荧光参数及高额产糖量的诱导模型，揭示了环境影子NO3-、NH4+、NO2-和 pH对甜菜氮素无机同化和蔗糖积累及产质量的调控效应，阐明环境因子对NR和NiR活性及其对块根产量、含糖率及产糖量的贡献率。