磷酸钙陶瓷微结构调控巨噬细胞信号分子分泌及其在材料骨诱导中的作用和机制

Macrophages and other inflammatory cells play a key role in determining the normal fracture healing response by secreting a large number of signaling molecules into the fracture site. Moreover, there exist some similar events involving cells and proteins between biomaterials implantation and fracture healing. Therefore, to further understand and reveal the osteoinduction mechanism of biomaterials from the level of cellular and molecular biology, based on the important role of biomaterials' microstructure and composition in inducing osteogenesis and influencing protein adsorption and cellular function, as well as the initial response of macrophages to the material when implanted into the body and its effect on the subsequent osteogenesis induced by the implant, we select calcium phosphate ceramics as material model in this project to study how the microstructure and phase composition of calcium phosphate ceramics regulate the secretion of various signaling molecules including pro-inflammatory cytokines and growth factors of macrophages, and their roles in affecting the osteoblastic differentiation of mesenchymal stem cells grown on the materials' surface, as well as their impacts on the materials' osteoinduction and the involved molecular mechanism, by the accurate design and fabrication of the materials' microstructure and phase composition, and the application of some advanced instruments and analytical methods about material characterization and biological tests. Finally, the results obtained by the above in vitro and in vivo experiments could give excellent experimental and theoretical support on exploring and revealing the osteoinduction mechanism of biomaterials.

巨噬细胞等炎性细胞的响应并分泌大量的信号分子在人体骨折修复过程中具有十分重要的作用，而生物材料体内植入后的系列细胞和分子事件与骨折修复过程存在一定的类似。因此，为进一步从细胞和分子生物学水平上深化认识生物材料骨诱导机理，本项目立足于表面微结构组成在生物材料骨诱导中的关键作用及其调控表面蛋白吸附和细胞功能特性的能力，以材料植入后的初始巨噬细胞响应及其分泌的信号分子对后续骨诱导发生的调控为研究切入点，选择磷酸钙陶瓷为基础材料，通过对材料微结构组成特征的精确设计和制备，结合先进的材料表征、细胞及分子生物学技术和手段，分别从体外细胞共培养和体内植入两个方面研究磷酸钙陶瓷微结构组成调控巨噬细胞功能及其分泌的两类信号分子，即促炎性细胞因子和生长因子对于MSCs成骨分化的影响，以及它们在材料骨诱导发生中的角色和作用关系机制，为探索和诠释生物材料骨诱导机理提供实验和理论基础。

磷酸钙陶瓷的骨诱导性已经得到广泛的证实和认可，但相关的机理仍不十分清楚。近年来，大量的研究结果表明免疫调控在组织再生中起重要作用。为此，本项目以磷酸钙陶瓷为对象，应用喷雾干燥、浆料发泡、泡沫浸渍、凝胶注射成型、微波辅助烧结等多种不同的方法构建了不同微结构组成的多孔磷酸钙陶瓷，评价其骨诱导性和骨缺损修复效果；同时利用Transwell体外细胞共培养模型、以及小鼠大腿肌内植入等，系统研究了材料微结构、晶粒尺寸、相组成等因素在蛋白吸附、调控巨噬细胞信号分子分泌及其对干细胞行为的影响。研究结果表明，控制磷酸钙前驱粉体和后续的材料成型和烧结工艺，可有效制备不同微结构组成和力学强度的多孔磷酸钙陶瓷，而且所制备的纳米晶多孔磷酸钙陶瓷颗粒和羟基磷灰石晶须增强多孔磷酸钙陶瓷不仅表现出优异的骨诱导性，而且在承力部位的节段骨缺损修复方面具有较好的临床应用前景；成功构建了小鼠骨诱导模型，筛选出骨诱导性最佳的多孔磷酸钙陶瓷用于后续的细胞和蛋白吸附研究；体外蛋白和细胞实验研究证实，多孔磷酸钙陶瓷上调吸附的粘附蛋白（VN和LN），可通过调控MSCs整合素基因表达，促进MSCs的粘附和成骨分化；纳米化表面可大幅提升多孔磷酸钙陶瓷的蛋白吸附能力，而且可通过上调MSCs的BMP-Smad信号通路基因表达，促进MSCs的成骨分化；相组成和降解产物在多孔磷酸钙陶瓷调控巨噬细胞炎性和生长因子基因表达和蛋白分泌上起重要作用，降解颗粒BPs的作用最强；通过Transwell模型研究MSCs的迁移，发现多孔磷酸钙陶瓷及其降解产物与巨噬细胞共培养后收集的条件培养基可显著促进MSCs的迁移和成骨分化，而且是CM-BPs的作用最强，充分印证前面BPs刺激局势细胞分泌更多的信号分子结果。由此推论，多孔磷酸钙陶瓷引发适度的机体免疫反应，导致材料局部微环境中形成较高浓度的信号分子环境，可募集MSCs并促进其向成骨方向分化，进而诱导新骨生成，初步揭示了材料激发的机体免疫反应在磷酸钙陶瓷骨诱导中的作用和相关机制。