人类细小病毒B19基因组中央polyA位点选择性使用的分子调控机制

Human parvovirus B19, a member of human erythrovirus genus, causes a number of human diseases, such as erythema infectiosum, acute and chrnoic arthropathy, aplastic crysis. B19 virus is spread primarily by infected respiratory droplets, blood borne transmission and vertical transmission from pregnant mother to baby. The viral genome contains two polyadenylation sites which control the abundance of different viral mRNAs. Its proximal polyadenylation signal (pA)p, which is in the middle of virus genome, not only blocks the transcription of its full length pre-mRNA, but also competes with the second intron splicing which is a necessary step to produce structure protein mRNA. Therefore, regulation of polyadenylation at (pA)p plays an important role both transcriptionally and posttranscriptionallly in the virus life cycle.However, the mechnism of polyadenylation at (pA)p is largely unknown. Based on our published work, we sought to study polyadenylation regulation at (pA)p by different factors such as viral DNA chromatin state, DNA replication of the viral genome and proteins that bind to intron splicing enhancer. The regulation of polyadenylation at (pA)p will be elucidated by the chromatin state and modification after virus entry into permissive cells. Whether DNA replication of viral genome affects polyadenylation at (pA)p directly or indirectly will be addressed by the relationship between viral genome replication and RNA splicing. what proteins binding to intron splicing enhancer and how those proteins affect polyadenylation at (pA)p will be tested both in vitro and in vivo. Fully understanding the regulation of polyadenylation at (pA)p provides not only the molecular biological regulation mechanism transcriptionally and posttranscriptionally, but also new insights to virus control, prevention and treatment.

细小病毒嗜红细胞属B19病毒通过呼吸道、血液和母婴传播等方式感染人导致多种疾病如感染性红斑（五号病）、急慢性关节炎和再生障碍性贫血等。B19病毒基因组含有两个polyA信号，直接调控病毒蛋白mRNA的表达水平。位于基因组中央的polyA信号（pA）p抑制病毒全长pre-mRNA的转录、第二个内含子剪切和结构蛋白mRNA的产生，（pA）p的使用成为病毒转录和转录后调控的关键环节，相关研究十分有限。本项目拟通过病毒感染系统研究病毒进入敏感细胞后的染色质状态及其修饰对polyA信号（pA）p使用的影响；构建（pA）p位点polyA信号报告质粒及突变体转染Cos7细胞研究DNA复制对内含子剪切以及（pA）p使用的影响；鉴定与病毒内含子增强子结合的蛋白及其影响（pA）p使用的机制。全面探讨polyA信号（pA）p的使用机制不仅阐明病毒转录和转录后调控的分子生物学机理，而且为病毒的防治提供新的思路。

人类细小病毒B19属于细小病毒科的嗜红细胞属，基因组为单链DNA，全长5.6kb。B19病毒基因组内有两个polyA信号，位于3'端的称为（pA）d，位于第二个内含子内的称为（pA）p。我们的研究表明，病毒基因组的复制和第二个内含子的剪切影响（pA）p的使用，但是复制如何影响（pA）p使用还不清楚。在基因组第二个内含子内存在一个内含子增强子序列ISE2，该序列促进第二个内含子的剪切，但是有哪些蛋白与之相互作用还不清楚。另外，研究发现细小病毒 MVM 和腺相关病毒AAV感染敏感细胞后，可以和组蛋白结合，形成类染色质结构，但是类染色质结构有哪些功能还没有相关报道。.因此，本研究的主要研究内容包括：探讨B19病毒基因组进入细胞后是否形成染色质结构以及类染色质结构的功能；研究病毒复制影响（pA）p使用的分子机制；寻找与ISE序列相互作用的蛋白。目前，本课题主要研究内容均已经完成，总结如下：.（1）B19基因组DNA可以在293T细胞内形成类染色质结构，而且类染色质结构的形成早于复制。5-Aza-2’-deoxycytidine（DAC）是一种甲基转移酶抑制剂，具有去甲基化作用。用DAC处理转染后的细胞，B19病毒类染色质结构形成和复制均明显被抑制，第二个内含子的剪切也明显被抑制，（pA）p的使用则明显增强。（2）分别利用IRES2-eGFP和pBluescript KSⅡ载体构建了基因组5’和3’端一半基因的复制型和非复制型克隆，并在此基础上做了敲除D1和D2剪切位点的克隆，48小时后提取总RNA，RPA检测。结果发现B19病毒的复制主要通过影响第二个内含子的剪切影响（pA）p的使用。（3）体外合成生物素标记的ISE2 RNA序列，与HeLa细胞核提取物孵育，进行RNA-蛋白钓取实验，质谱结果显示，九种蛋白可以特异性的与ISE2结合，其中FUS蛋白，DDX5蛋白和PSPC1蛋白与RNA的剪切有关。.本研究揭示了B19病毒类染色质结构在调控基因表达和RNA加工过程中的功能，阐明了B19病毒基因组中央poly位点选择性使用的分子调控机制，为B19病毒的防治提供了理论依据。