microRNA调控乳腺癌启动细胞向血管内皮细胞转化的机制研究

成瘤性肿瘤启动细胞是乳腺癌发生、扩散、转移和复发的源泉，肿瘤启动细胞来源的新生血管的生成在肿瘤的发生侵袭转移的过程中均发挥着重要作用。本项目将在前期对乳腺癌启动细胞microRNA调控机制研究的基础上，进一步建立体外诱导乳腺癌启始细胞向血管内皮细胞分化的模型，筛选乳腺癌启动细胞向血管内皮细胞方向分化过程中差异表达的miRNA，分析miRNA调控肿瘤启动细胞向血管内皮细胞分化的靶基因蛋白，并在体外和体内肿瘤启动细胞分化模型中通过干预miRNA表达探索其对肿瘤启动细胞分化方向的调控作用，以及由此对肿瘤成瘤、侵袭和转移的影响。本研究将是肿瘤组织中新生血管生成的分子机制研究的新切入点，为阐明miRNA调控肿瘤启动细胞分化命运的机制奠定基础，并为研制肿瘤抗血管靶向治疗提供新的基因干扰靶点。

我们首先建立体外诱导乳腺癌干细胞向血管内皮细胞分化的模型；分析了乳腺癌干细胞向血管内皮细胞分化前后的miRNA表达差异，并筛选出调控这一分化过程的miRNA及下游信号通路；探讨引起靶miRNA表达差异的机制；体内实验观察该miRNA对肿瘤生长、转移和血管生成的影响。并且还研究了microRNA调控乳腺癌干细胞其他的生物学特性，包括上皮-间质转化，自我更新能力，化疗耐药等；另外我们还研究了肿瘤微环境中的CCL18通过microRNA调控乳腺癌细胞的侵袭和转移。.我们从乳腺癌细胞株或原代乳腺癌细胞富集的乳腺癌干细胞经过VEGF诱导2周后能表达VEGFR2、CD31和vWF等内皮细胞标记物，在matrigel三维培养中成管，受组胺刺激后能释放vWF，并促使细胞内源性VEGF的分泌。但非乳腺肿瘤启动细胞受VEGF刺激后不能表达上述内皮细胞标记物，也无法在三维培养中成管。.miR-27a在VEGF诱导的乳腺癌干细胞中的表达为未诱导细胞的15.36倍。EMSA和ChIP实验表明VEGF能促使乳腺癌干细胞内的转录因子Runx1与miR-27a基因上游的调控序列结合，沉默细胞Runx1的表达后，miR-27a水平下降。通过调控mir-27a的表达水平，我们发现miR-27a水平上调能促使癌干细胞表达内皮细胞标记，下调能降低内皮标记物的表达、成管能力和抑制内源性VEGF的分泌。.miR-27a通过抑制靶蛋白ZBTB10，升高转录因子Sp1以及Sp1依赖的VEGFR2和VEGF的表达水平，从而影响VEGF诱导的内皮分化过程。在动物模型中，我们发现高表达miR-27a和低表达ZBTB10的荷植瘤生长较快，较易发生肝肺远处转移。与对照组相比，实验组瘤内血管管腔较大，微血管密度增高。.因此，VEGF诱导的乳腺癌干细胞能分化成有功能的血管内皮细胞。在VEGF诱导的乳腺癌干细胞中，VEGF通过Runx1/miR-27a/ZBTB10/Sp1来调控乳腺癌干细胞向血管内皮细胞分化的过程。miR-27a可以促进乳腺肿瘤的生长和转移。