牛流行热病毒诱导细胞自噬的分子机制研究

Bovine ephemeral fever was an acute febrile diseases caused by bovine ephemeral fever virus (BEFV), the disease was difficult to effective prevention and control by means of a single causing serious economic losses to the cattle industry. We found that BEFV infection and BEFV G gene could induce autophagy, and the key autophagy-associated host genes were initially screened after BEFV infection, but it remains unknown the relationship and regulation mechanism of cellular autophagy in infection of bovine ephemeral fever virus.In this study, we focus on the interaction of host cell autophagy and BEFV infection.Using over-expression of the viral genes in cells, the change of biomarkers of autophagy will be detected, and the key autophagy-related viral genes will be found. Furthermore, after host cells treated with different autophagy inhibitors or inducers, the progeny virus yield will be analyzed by TCID50, and then the effect of autophagy on virus proliferation will be evaluated. Moreover, the mRNA expression profiles of host cells will be analyzed and compared, after viral infection at 12h, 24h, 36h and 48h, differentially expressed genes mainly involved in autophagy will then screened, and BEFV inducing autophagy signaling pathway will be finally determined. This study will provide dynamic and useful information between interaction of virus and host, the role and autophagic machinery in infection of BEFV will be explained, and the new targets and strategies will be found in the prevention and control of bovine ephemeral fever.

牛流行热是由牛流热病毒（BEFV）引起的急性、热性传染病，通过疫苗免疫的单一手段难以有效防控，给养牛业造成严重的经济损失。我们的前期研究发现，BEFV感染和BEFV的G基因能诱导细胞自噬，自噬能抑制BEFV增殖，还发现了BEFV感染后参与自噬相关的宿主基因，而BEFV感染诱导细胞自噬的分子调控机制尚不清楚。因而，本研究拟从BEFV感染与宿主细胞自噬间的相互作用出发，通过过表达病毒基因，检测自噬标志分子的表达变化，筛选并验证可引起自噬的病毒基因；利用自噬诱导剂或抑制剂处理易感细胞，检测病毒滴度与病毒基因表达变化，发现细胞自噬抑制BEFV复制的分子机制；利用RNA-seq表达谱测序，系统分析BEFV感染后不同时间宿主细胞基因表达变化，进一步筛选并验证引起自噬的关键宿主基因，解析BEFV诱导细胞自噬的信号传导通路，深入探讨细胞自噬在BEFV感染中的作用及机制，为BEFV防控提供药物靶点和新思路。

牛流行热是由牛流热病毒（BEFV）引起的急性、热性传染病，通过疫苗免疫的单一手段难以有效防控，给养牛业造成严重的经济损失。我们的前期研究发现，BEFV感染能诱导细胞自噬，自噬能抑制BEFV增殖，而BEFV感染诱导细胞自噬的分子调控机制尚不清楚。本研究从BEFV感染与宿主细胞自噬之间的相互关系角度出发，探讨细胞自噬在BEFV感染中的作用。研究发现，BEFV感染后，LC3A/B积累而p62降解，表明BEFV诱导了完全自噬的发生；而且BEFV感染后促进LC3B的点状聚集斑点化，说明BEFV促进自噬小体的形成。分别使用自噬诱导剂Rapamycin、自噬抑制剂CQ处理细胞，表明Rapamycin促进BEFV感染诱导的细胞自噬，而CQ抑制BEFV感染诱导的细胞自噬。体外过表达病毒基因，Western Blot检测细胞自噬标志性分子LC3A/B及p62，发现过表达BEFV的α1基因促进LC3B斑点化聚集和p62降解，表明α1诱导细胞自噬的发生。为筛选与α1互作的宿主基因，分别利用RNA-seq技术和酵母双杂交技术进行筛选。利用RNA-seq技术，发现上调基因1949个、下调基因2017个；这些差异表达的基因参与自噬、凋亡、免疫、生物调节等生物学过程，其中细胞自噬信号通路的相关基因表达显著上调。通过酵母双杂交实验，共获得221个酵母菌，95条注释信息。分别对经RNA-seq和酵母双杂交筛选的30余个基因进行荧光定量PCR分析，筛选出BNIP3/NIX等8个上调表达的候选宿主基因，其中BNIP3/NIX过表达显著促进BEFV的复制。过表达NIX促进p62、LC3A/B的降解；而敲除NIX使p62、LC3A/B积累，表明NIX促进细胞自噬。通过蛋白质免疫共沉淀技术，发现NIX和BEFV的α1互作，初步将互作位点定位于α1-13节段。本研究揭示了BEFV感染诱导细胞自噬的分子机理，丰富病毒感染、复制及致病机制，为预防和控制牛流行热提供药物靶点和新的思路。本项目发表SCI论文5篇，获得山东省高等学校科学技术奖一等奖1项，培养毕业博士/硕士研究生4名。