小反刍兽疫病毒诱导山羊子宫内膜细胞自噬的分子机制研究

Peste des petits ruminants virus (PPRV) is an important pathogen that seriously influences the productivity of goat worldwide. Although PPRV is known to induce autophagy in infected cells, the mechanisms underlying the autophagy still is unclear. In the present study, the key proteins of PPRV relative trigger autophagy in goat endometrial epithelial cells (EEC) will be determined by using eukaryotic transfection technique, RNAi assay, and transmission electron microscopy. And the functional domain or region will also be further determined by the above methods. Furthermore, the effects of autophagy blocking in EEC on the PPRV progeny yield were detected using Baf-A1 treatment/LAMP-2 interference, laser confocal scanning, quantitative RT-PCR, and Western blot assay. the key proteins of EEC related with autophagy induced by PPRV proteins are screened and validated by yeast two-hybrid, Co-IP, laser confocal microscopy, mTOR、AMPK phosphorylation level is detected by Western Blotting, Autophagy signaling pathways induced by PPRV is uncovered through express degree of Beclin-1/PI3K- III. The study will provide a theoretical basis to understand the autophagy as well as exploit a strategy for PPR control.

小反刍兽疫(PPR)为严重危害小反刍兽的一类动物疫病。小反刍兽疫病毒(PPRV)能诱导宿主细胞自噬并促进病毒复制，但其机制尚不清楚。本研究采用真核转染、RNA干扰及透射电镜显微观察等技术，首先鉴定PPRV诱导山羊子宫内膜细胞（EEC）自噬的作用，进而筛选出PPRV诱导自噬的相关病毒蛋白，通过丙氨酸扫描鉴定其功能位点或功能域。结合Baf-A1处理及干扰LAMP-2、激光共聚焦、Western blot等技术阻断自噬，检测其对PPRV增殖的影响，证实自噬蛋白对病毒复制的作用。借助酵母双杂交、Co-IP、激光共聚焦方法筛选、验证与PPRV蛋白相互作用的宿主细胞自噬相关蛋白。通过Western Blotting 检测mTOR、AMPK磷酸化水平，以Beclin-1/PI3K- III表达高低揭示PPRV诱导自噬的信号通路。该研究对小反刍兽疫防控具有重要的理论指导意义和潜在的应用价值。

小反刍兽疫（PPR）是世界动物卫生组织（OIE）法定报告的动物疫病，是我国政府规定的一类动物疫病，迄今，全球超过70个国家确认境内发现小反刍兽疫。我国是养羊大国，年均饲养量均超过4亿只。2014年我国先后有25个省市自治区发生PPR疫情，造成了巨大的经济损失和严重的社会影响。研究小反刍兽疫病毒（PPRV）致病机制对促进养羊业发展有重要意义。.本研究主要内容包括：PPRV诱导山羊子宫内膜上皮细胞自噬的鉴定，PPRV诱导EEC自噬的相关病毒蛋白筛选及鉴定；山羊子宫内膜上皮细胞自噬对PPRV病毒复制的作用；小反刍兽疫病毒入侵宿主细胞途径研究。研究发现，PPRV在山羊子宫内膜上皮细胞增殖过程中能诱导完全细胞自噬。PPRV的N、C、H蛋白在诱导细胞自噬的过程中均发挥了重要作用，PPRV及其H蛋白结合受体Nectin-4引发第一波自噬始于细胞膜，PPRV的C蛋白和N蛋白通过与IRGM和HSP70分子互作共同调控第二波自噬的发生。PPRV诱导的自噬有助于增强病毒在宿主细胞中的复制，促进自噬可以增强PPRV的复制，抑制自噬也会减弱病毒的毒价以及病毒蛋白的表达。另外进一步研究发现，PPRV通过依赖于胆固醇依赖的小窝蛋白介导的机制入侵EECs，该过程依赖于低pH值且需要发动蛋白和PI3K的参与，不依赖于网格蛋白。.本研究获得的小反刍兽疫病毒(PPRV)诱导宿主细胞自噬及其对病毒复制的影响相关成果，对揭示小反刍兽疫病毒致病机制及抗病毒免疫有重要科学价值。