衣藻叶绿体基因组的体外重组与表达研究

The chloroplast transformation approach which offers several unique advantages, including high-level transgene expression, lack of gene silencing and position effects and natural containment of transgenes of lack of pollen transmission is an important tool in plant genetic enineering. However, there are several limitations of chloroplast transformation, such as low efficiency of recombination and dependent of genotypes. In this study, the in vitro recombination techniques of Baculovirus Expression Vector System(BEVS) will be used to chloroplast trasnformation in order to develop an alternative new approach of Chlamydomonas reinhardtii chloroplast transformation. The Porcine Circovirus type II(PCV II) capsid gene will be expressed in the new system. In the process of this in vitro recombination, BAC replicon and oriV will be introduced into the chloroplast genome and the recombinant chloroplast genome can be replicated in E. Coli. Then, the recombination between the target gene and chloroplast genome will be accomplished efficiently in E. Coli under the λ Red Recombinase. The recombinant chloroplast genome carrying the target gene will be obtained rapidly depending on the system of reverse selection. At last, the recombinant chloroplast genome carrying the target gene will be transmitted into the Chlamydomonas reinhardtii chloroplast and the target gene (PCV II cap) will be expressed at a high level. The establishment of new chloroplast transformation system will not only serve as a powerful tool but also make a broader impact on plant genetic engineering through agricultural and industrial applications.

叶绿体转化技术体系具有表达量高、环境安全性好等优点，是植物遗传工程重要的研究领域之一。本研究针对叶绿体内重组率低、过于依赖基因型等问题，将杆状病毒表达系统建立的体外重组技术应用到叶绿体转化技术中，在叶绿体外完成外源基因与叶绿体基因组的重组，建立衣藻叶绿体表达体系并表达功能基因猪圆环病毒主要抗原基因。在体外重组过程中，首先向叶绿体基因组中引入BAC复制子以及oriV多拷贝复制起点，能够在大肠杆菌中大量复制，获得足够的重组DNA；然后应用λ Red Recombinase系统，使之在叶绿体外高效重组外源基因；此外，利用反向选择标记基因系统，快速、有效地获得含有目的基因的叶绿体基因组重组载体，再利用基因枪等方法将重组载体转化到衣藻叶绿体中获得表达。本研究将建立衣藻叶绿体体外重组技术体系，并利用该体系表达猪圆环病毒主要抗原基因，其结果不仅具有基础理论意义，还具有实际应用价值。

叶绿体转化技术体系具有表达量高、无基因沉默和位置效应以及因母系遗传而不会发生由花粉传递而造成转基因逃逸的环境安全问题等优点，是植物遗传工程重要的研究领域之一。自1988年Boynton等首次转化单细胞低等植物衣藻叶绿体，1990年高等植物烟草的叶绿体转化也获得成功。到目前为止，已经有10几种植物的叶绿体转化获得成功。然而目前的叶绿体转化普遍存在体内重组率低、过于依赖基因型等问题，本研究针对以上问题，将杆状病毒表达系统中成功建立和应用的体外重组技术应用到叶绿体转化技术中，在叶绿体外完成外源基因与叶绿体基因组的重组，建立衣藻叶绿体表达体系并表达功能基因猪圆环病毒流行毒株II型主要抗原基因核衣壳蛋白cap。在体外重组过程中，首先设计引物通过PCR方法克隆了2对衣藻叶绿体同源片段，chlL 与petB、atpA 与rbcL，用于衣藻叶绿体的体外重组；向叶绿体基因组中引入CopyControlTM pCC1BACTM中的BAC复制子以及oriV多拷贝复制起点，使叶绿体基因组能够在大肠杆菌中大量复制，获得足够的重组DNA；然后应用λ Red Recombinase系统，使之在叶绿体外高效重组外源基因；此外，在体外重组中引入反向选择标记基因rpcL-neo（卡那霉素抗性（+）和链霉素抗性（-）），利用反向选择标记基因系统，快速、有效地获得含有目的基因的叶绿体基因组重组DNA，并在大肠杆菌中大量复制，获得足够的叶绿体基因组重组DNA，再利用基因枪等方法将基因组重组DNA转化到衣藻叶绿体中获得表达。将获得的衣藻转化子在含有壮观霉素抗性的液体培养基TAP中进行同质化筛选，并连续提高液体培养基TAP中壮观霉素的选择压力，从100mg/L提高到150mg/L，再到200mg/L直到300mg/L，经过6轮次的筛选后，通过分子检测证明获得了完全同质化的衣藻转化子。另外，在大肠杆菌中表达了猪圆环病毒的核衣壳蛋白，并用其制备了多克隆抗体，用于检测衣藻叶绿体中目的蛋白的表达。Western blot和ELISA检测结果证明目的基因在衣藻转化子中获得表达，表达量占可溶性蛋白的1%左右。动物免疫实验表明：表达的猪圆环病毒抗原蛋白具有一定的免疫原性。本研究建立了衣藻叶绿体体外重组技术体系，并利用该体系表达猪圆环病毒主要抗原基因，其结果不仅具有基础理论意义，还具有实际应用价值。