茉莉酸信号组分CdMYC2及其调节的CdWRKY26基因在野生狗牙根抗寒中的功能及抗寒分子机理解析

Low temperature is considered as the key factor limiting bermudagrass utilization. Discovering key cold-responsive genes and then improving bermudagrass cold resistance by modern breeding technology, is one of the most important methods to obtain bermudagrass varieties resistant to cold stress. In previous study, we identified a low temperature induced CdMYC2 gene, an important regulator in JA signal, using RNA-seq technology; Besides, CdWRKY26 protein, which was involved in response to low temperature regulated by JA signal, was identified by using iTRAQ technology. CdWRKY26 gene expression was significantly suppressed in leaves of bermudagrass, of which CdMYC2 gene expression was down-regulated by VIGS. Besides, the partial length promoter of CdWRKY26 gene was cloned and analyzed, and it was found that it contains the G-box elements bound by MYC2 transcription factor. These results suggested that CdWRKY26 acts downstream of CdMYC2 to be involved in regulation of low temperature response by JA. On this basis, our present study will use yeast one hybrid, EMSA and transient expression analysis to investigate whether CdMYC2 binds the promoter of CdWRKY26 directly to activate the expression of CdWRKY26. The basic characteristic of CdMYC2 and CdWRKY26 as transcription factor will be determined. To identify the function of CdMYC2 and CdWRKY26 gene, over-expression and VIGS technology will be employed. Moreover, the molecular mechanism of CdWRKY26 gene in regulating bermudagrass response to cold will be revealed based on transcriptomics. The study will provide elite gene resource for bermudagrass breeding for cold resistance. Moreover, the study will provide important evidence for elucidating the molecular mechanism of JA-regulated cold stress.

低温是限制狗牙根推广应用的主要因素。从野生狗牙根中发掘抗寒基因，通过现代育种技术改良其抗寒性，是获得狗牙根抗寒品种的重要手段。前期研究我们鉴定到JA信号中受低温诱导表达的CdMYC2基因；用iTRAQ技术鉴定到CdWRKY26参与JA调控的低温应答；利用病毒介导的基因沉默（VIGS）抑制CdMYC2基因表达的狗牙根中，CdWRKY26基因表达也受到显著抑制，且CdWRKY26启动子中含MYC2结合元件，表明CdWRKY26位于CdMYC2的下游来参与JA调控的低温应答。在此基础上，本项目将利用酵母单杂交、瞬时表达等技术研究CdMYC2通过与CdWRKY26启动子的结合来调节其表达；研究CdMYC2和CdWRKY26转录因子的特征，通过转基因超表达、VIGS和转录组学等技术研究它们的抗寒功能及抗寒分子机理。项目实施将为狗牙根抗寒育种提供重要基因资源，为解析JA调控植物耐寒性提供重要科学依据。

低温是限制狗牙根推广应用的主要因素。从野生狗牙根中发掘抗寒基因，通过现代育种技术改良其抗寒性，是获得狗牙根抗寒品种的重要手段。我们研究发现外源施加茉莉酸（JA）可显著提高狗牙根的耐寒性，且JA信号通路中的CdMYC2转录因子受低温胁迫诱导表达。应用iTRAQ技术发现CdWRKY26蛋白水平受低温诱导；在低温施加JA的情况下，CdWRKY26蛋白表达被进一步诱导，表明CdWRKY26参与JA调控的低温胁迫应答。利用病毒介导的基因沉默（VIGS）技术抑制CdMYC2基因的表达后，CdWRKY26基因的表达无论在对照还是低温处理下均受到显著抑制。利用Genome walking方法克隆了CdWRKY26基因启动子，长度为1.1 kb，发现序列中存在4个MYC2结合的G-box应答元件，表明CdWRKY26可能处于CdMYC2的下游来参与JA调控低温胁迫的应答。酵母单杂交实验进一步证实CdMYC2可以直接结合CdWRKY26基因的启动子，明确了CdWRKY26基因在JA调控网络中的遗传作用位点。功能分析揭示CdWRKY26过表达转基因拟南芥抗寒性显著提高，利用VIGS技术抑制CdWRKY26表达的狗牙根植株抗寒性显著降低，表明CdWRKY26正向调控植物耐寒性应答。此外，抑制CdMYC2表达在一定程度上降低了狗牙根植株的抗寒性，尽管过表达CdMYC2的转基因拟南芥植株抗寒性与对照无显著区别。为了进一步研究CdWRKY26基因参与抗寒性调控的分子网络，以空载对照（EV）植株和CdWRKY26过表达转基因（OE）植株为实验材料，分析它们在对照及低温处理下的表达模式，在低温情况下共鉴定到2063个在过表达中上调表达的基因、2087个下调表达基因（OE LT vs EV LT）。有意思的是参与多胺和脯氨酸合成的相关基因在过表达材料中被显著诱导，表明CdWRKY26可能通过调控多胺和脯氨酸合成通路来参与低温胁迫应答。综上所述，我们研究揭示了CdWRKY26基因在JA调控低温应答网络中的遗传作用位点；明确了CdMYC2和CdWRKY26转录因子在狗牙根低温胁迫应答中的功能及抗寒分子机理。研究结果无论对于狗牙根抗寒育种实践，还是对抗寒机理的基础科学研究，均具有十分重要的理论和现实意义。