间斑寇蛛卵粒毒素-VI影响PC12细胞多巴胺代谢与释放的分子机制研究

Some natural toxins target the synapse and thus can be used as molecular tools. Investigation of their functions and action mechanism not only deepens our understanding of the toxins themselves, but also helps to dissect the molecular mechanism for regulation of synaptic transmission. Synaptotagmin and Rab3 play key roles in the regulation of synaptic transmission, and the regulatory action of Rab3 involves a Rab3 cycle. Our previous work for the first time demonstrated that Rab3A could regulate the vesicle fusion and dopamine release through direct interaction with synaptotagmin I; when the Latroeggtoxin-VI,a peptide toxin from the eggs of Latrodectus spider, was preliminarily investigated,the toxin was found to be able to promote dopamine release from PC12 cells, enter the cells via synaptotagmin I mediation to interact with Rab3 cycle and related proteins (enzymes), and enter the nucleus to interact with the transcription-related enzymes and regulatory factors. The present project will, on the basis of our previous work, probe into the process and molecular basis for Latroeggtoxin-VI to enter the PC12 cells ,not only revealing molecular mechanism underlying the effect of Latroeggtoxin-VI on the metabolism and release of dopamine,but also accumulating new experimental data for elucidating the regulatory mechanism of synaptic transmission, and establishing preliminary foundation for probing the potential of the toxin in the pharmacological research and the treatment of related diseases.

某些天然毒素能以突触为靶标发挥作用，因而可作为分子工具使用。研究它们的功能和作用机理不仅可以加深对其本身的了解，而且可以帮助解析突触传递的分子机制。突触结合蛋白（Syt）和Rab3蛋白在突触传递调节中起关键作用，Rab3发挥调节作用时涉及一个Rab3循环。我们的前期工作首次证明Rab3A能通过与Syt I的直接互作调节囊泡的融合和多巴胺释放；在研究间斑寇蛛卵粒毒素-VI时，发现该毒素能促进PC12细胞多巴胺的释放，能经Syt I介导进入PC12细胞质与Rab3循环及相关蛋白（酶）作用，并可进入细胞核与转录有关的酶和调节因子作用。本项目拟在前期工作基础上，探究间斑寇蛛卵粒毒素-VI进入PC12细胞的过程与分子基础、阐明其影响多巴胺代谢与释放的分子机理，并为研究突触传递调控机制积累新的实验资料，为揭示间斑寇蛛卵粒毒素-VI在药理学研究和相关疾病的治疗等方面的潜在意义奠定初步基础。

间斑寇蛛卵粒毒素-VI (LETX-VI)是利用基于转录组分析的策略从间斑寇蛛L. tredecimguttatus卵粒中发现的一种蛋白质类神经毒素。本项目系统探究了LETX-VI影响PC12细胞中多巴胺合成、转运和释放的作用机制以及在防治多巴胺相关疾病中的意义。.研究证明LETX-VI能通过囊泡胞吐/内吞循环迅速穿过PC12细胞质膜。LETX-VI进入细胞时，囊泡膜上的跨膜蛋白突触结合蛋白1（Syt1)作为受体,通过其囊泡内腔的N-端结构域与LETX-VI 的C-端区域相互作用。LETX-VI 的C-端序列是LETX-VI穿膜进入细胞和促进多巴胺释放的主要功能区域。丙氨酸扫描证明LETX-VI分子中的K25,K35, K40，R41和L45是LETX-VI发挥功能的关键残基。.LETX-VI上调酪氨酸羟化酶(TH)和左旋多巴脱羧酶的表达，下调单胺氧化酶B的表达,从而促进多巴胺的合成，抑制其降解；同时,通过调节囊泡单胺转运蛋白2和多巴胺转运体的丰度和/或翻译后修饰水平，促进多巴胺的转运和释放。LETX-VI 还抑制Syt1分子中 T201和T195位点的磷酸化水平,从而促进囊泡与质膜的融合和多巴胺的释放。此外,LETX-VI能同时开放质膜和内质网(ER)膜上的Ca2+通道,促进细胞外Ca2+内流和ER Ca2+释放,从而提高胞浆Ca2+离子浓度，增强LETX-VI促进PC12细胞合成和释放多巴胺的作用。.α-突触核蛋白的过表达显著降低PC12 细胞的多巴胺水平,而LETX-VI可以阻止α-突触核蛋白的异常累积，有效缓解其过表达对多巴胺的不利影响。在MPTP诱导的 帕金森病（PD）小鼠模型中, LETX-VI可改善小鼠的帕金森行为,减少MPTP诱导的α-突触核蛋白的上调和TH的下调。此外,LETX-VI抑制小鼠大脑组织中MPTP引起的TH阳性和尼氏染色神经元数目的减少。LETX-VI能抑制LPS诱导的 NF-κB炎症信号通路激活，减轻LPS对抗炎因子表达的抑制作用。在LPS诱导的抑郁症小鼠模型中,LETX-VI预处理能改善LPS引起的小鼠抑郁样症状,抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的激活,减轻LPS对脑组织的不利影响。这些实验结果证明LETX-VI可以穿过细胞质膜，通过多种机制促进多巴胺的合成、转运和释放，在药物的跨膜传送和相关疾病的防治方面具有潜在的应用价值。