间斑寇蛛卵粒蛋白质与多肽类毒素的生物化学研究

蜘蛛毒液中的许多活性成分在生物杀虫剂的研制、神经生物学和神经药理学研究的工具试剂的研发等方面具有重要的应用前景。早期的文献报道和我们的前期研究结果发现，间斑寇蛛卵粒含有大量蛋白质和多肽类毒素成分，其提取物能阻断小鼠膈神经-膈肌标本的神经肌肉接头传递。但至今从未对其活性成分的结构与功能及其形成机制开展过深入的研究，是目前自然界的一个未解之谜。本项目将在前期研究工作基础上，对间斑寇蛛卵粒中的蛋白质和多肽活性成分展开系统的分离纯化和结构与功能研究。该项目研究的开展将在蜘蛛毒素的研究方面开辟新的研究领域，取得具有原创性的研究成果。

间斑寇蛛（L.tredecimguttatus, 俗称“黑寡妇”蜘蛛）的毒素不仅存在于毒腺中，而且存在于身体的其它部分、幼蛛和卵粒之中。研究间斑寇蛛毒腺外材料中的毒素成分，探讨其与毒腺毒素的异同，不仅可以帮助了解相关毒性机制，获得具有原创性的研究成果，而且能为毒素资源的开发利用筛选新的前体分子。本项目着重对间斑寇蛛卵粒中的蛋白质和多肽类活性成分展开生物化学研究，不仅对卵粒提取物的理化和生物学性质进行了较为系统的探究，而且从中分离纯化出几种活性蛋白质和多肽成分并对其结构和性质进行了分析，取得了具有重要理论和实践意义的实验结果。 .理化和生物学性质分析结果表明，卵粒提取物富含高分子量的蛋白质和分子量5000 Da以下的多肽，对小鼠和蜚蠊显示很强的毒性，能够阻断小鼠膈神经-膈肌标本的神经肌肉传导，这种阻断作用主要由卵粒中的蛋白质成分所致。膜片钳实验证明，卵粒提取物能抑制大鼠DRG细胞的电压门控Na+, K+ 和 Ca2+通道电流。酶学分析显示间斑寇蛛卵粒富含水解酶类。这些结果证明卵粒中多种神经毒素以及其它一些活性成分的存在构成了卵粒毒性的分子基础。采用蛋白质组学策略从卵粒中鉴定出157种蛋白质。对比分析表明，卵粒的蛋白质组成比毒腺毒液的更加复杂，二者的相似性很小。卵粒中未鉴定出毒液中的代表性间斑寇蛛毒素Latrotoxins及其它已知毒素，提示卵粒具有自己独特的、与毒腺毒液不用的毒性机制。综合利用多种生化分离技术从卵粒中分离纯化出3种活性蛋白和一种多肽，分别命名为Latroeggtoxin-I、-II、-III 和-IV，对其结构和性质进行了测定和分析并运用多种蛋白质组学技术证明它们是从间斑寇蛛卵粒中分离纯化出的新型毒性成分。其中，Latroeggtoxin-II能特异性抑制大鼠DRG细胞的TTX-R 型Na+通道，而对TTX-S 型Na+通道无明显作用，从而在疼痛研究及相关药物的研发中显示一定的应用前景。该蛋白质已申请国家发明专利并已得到正式受理。新生幼蛛被证明具有与卵粒和毒腺相似的毒性，富含神经毒素和离子通道活性成分，但总的毒性低于卵粒和毒腺。幼蛛的蛋白质组成与卵粒的非常相似，提示其毒性机制与卵粒的相似而与毒腺的具有较大差异。此外，针对毒素的性质和作用特点还进行了相关方法学研究，为卵粒毒素研究的深入开展建立和优化了实验条件。