AGO4介导的DNA甲基化等表观遗传途径调控拟南芥体细胞胚胎发生中全能性胚胎干细胞形成的机理研究

Epigenetic modifications are very important for the somatic embryogenesis. However, a little is known on molecular mechanisms of epigenetic regulation on cell totipotency in plants. Based on the previous study, the production of somatic embryos depends on a certain level of DNA methylation. But relatively little is known about how the DNA methylation affects the cell totipotency expression. During somatic embryogenesis in Arabidopsis, we identified the highly expressed DNA methylation regulating gene AGO4, which encodes a protein involved in epigenetic modifications through the RNA-dependent DNA methylation. We found that overexpression of AGO4 induced somatic embryos formation and expression of plant cell totipotency. Furthermore, AGO4 was found to function in zygotic embryogenesis in vivo. In this study, we will identify target genes of AGO4 through genetic analysis, transcriptome or DNA methylation assays. We will reveal the molecular mechanisms of AGO4 in controlling cell totipotency and zygotic embryogenesis. The study might provide novel and critical information for understanding molecular mechanisms of epigenetic modification-regulated cell totipotency in plants.

表观遗传修饰在体细胞胚胎发生过程中发挥着关键的作用，但是其调控植物细胞全能性表达的机理到目前为止并不清楚。研究表明，在体细胞诱导转化为胚性细胞时，基因组DNA甲基化水平发生显著变化，但是DNA甲基化是如何影响细胞全能性表达的机理目前还知之甚少。在本项目前期的研究工作中，我们鉴定到在拟南芥体细胞胚胎发生时特异高水平表达的DNA甲基化调节基因AGO4，该基因编码的AGO4蛋白是依赖于RNA的DNA甲基化调控途径中的关键因子。我们发现该基因具有诱导植物体细胞表达细胞全能性，转变成胚胎干细胞并再生体细胞胚的生物学功能。并且该基因也参与调节合子胚的发生和发育。本项目拟利用遗传学、转录组学和基因组DNA甲基化测序等方法鉴定AGO4在诱导胚胎干细胞表达以及合子胚发育过程中的下游靶基因，从而深入分析AGO4介导的分子遗传途径。研究结果将为解析表观遗传途径调控植物细胞全能性表达的分子机理提供重要遗传信息。

体细胞胚胎发生是研究体细胞重编程和细胞命运转变的重要过程，已经报道表观遗传修饰在体细胞胚胎发生过程中发挥着关键作用。尽管有研究表明，DNA甲基化在诱导体细胞胚的形成过程中发生了明显变化，但DNA甲基化如何调控体细胞胚胎发生的分子机制还并不十分了解。前期的工作中鉴定到在拟南芥体细胞胚胎发生中，DNA甲基化调节基因AGO4高水平表达，该基因编码的AGO4蛋白是依赖于RNA的DNA甲基化调控途径中的关键因子。本研究发现，AGO4突变导致体细胞胚胎发生的能力相比野生型显著下降，而过量表达AGO4能显著促进体细胞胚的形成，说明AGO4介导的DNA甲基化可能是调控体细胞胚胎发生的重要因素。WGBS测序分析发现，DNA甲基化水平在体细胞胚胎发生过程中显著升高，其中CHH甲基化水平是变化最明显的。通过WGBS与转录组联合分析发现，在体细胞胚的诱导过程中AGO4介导的DNA甲基化可以沉默气孔前体干细胞特异表达的小肽EPF2和CLE9。进一步研究发现，EPF2和CLE9基因功能缺失可以促进体细胞胚胎发生，而EPF2与CLE9的磷酸化靶蛋白SPCH过量表达同样能促进体细胞胚的产生，同时体细胞胚形成所必需的生长素内源合成和响应信号也显著增强。在epf2和cle9突变体中诱导体胚发生，SPCH蛋白的水平也是显著升高的。以上结果表明，DNA甲基化通过降低小肽EPF2和CLE9的表达来调控SPCH蛋白的稳定性，进而促进体细胞胚胎发生。另外组学分析还发现，体胚诱导过程中调控愈伤组织形成的关键基因LBD16的基因体（gene body）区域DNA甲基化水平与其转录水平是正相关的。通过对LBD16的功能分析发现，过量表达LBD16能够促进体细胞胚胎发生，并且LBD16与体胚诱导关键因子LEC2是直接相互作用的，这表明受DNA甲基化调节的LBD16可能通过与LEC2互作参与调控体细胞胚胎发生。以上结果说明，DNA甲基化通过调控靶基因EPF2、CLE9和LBD16的表达来促进体细胞胚胎发生。本研究为DNA甲基化调控体细胞胚胎发生的分子机理提供了新的重要信息。