基于大体系下(50 mL)纳米免疫磁珠高效富集单核增生李斯特菌的方法学研究

Immunomagnetic separation (IMS) has become one of the most important techniques in foodborne pathogen rapid screening process. IMS is efficient in target bacteria enrichment from complicated food samples, and thus improve the detection sensitivity. The capture efficiency of existing static immunomagnetic separation methods are high, however, the enrichment factor of these methods are low owing to the small processing ability itself (1-1.5 mL). Thus, it is essential to enlarge the sample volume in order to reach higher enrichment factor. Theoretically, the amount of magnetic beads will increase 10 times when increase the sample volume from 1-1.5 mL to 50 mL, which will cause a significant increase of the direct cost. In this proposal, Listeria monocytogenes and nano-magnetic beads with diameter of 100 and 200 nm will be employed to set up the separation model. The theoretical basis of decreasing the amount of immunomagnetic beads in 50 mL system will be discussed by increasing the antibody binding capacity and the number of nano-magnetic beads on the surface of L. monocytogenes. The characterization of magnetic field for nano-magnetic bacteria rapid separation in a large volume will be determined by cell tracking velocimetry measurement combined with mathematical modeling analysis of magnetic separation. Taken together, the final goal of this proposal is to establish a theoretical foundation of using magnetic nanobeads for highly efficient separation of L. monocytogenes in a large volume (50 mL).

免疫磁分离技术是食源性致病菌快速筛查技术的重要组成部分之一，该技术可高效捕获、浓缩增菌液中目标菌，提高致病菌检测灵敏度。现有的静态免疫磁分离方法因分离体积小（1～1.5 mL）而致富集效率低。增大磁分离体积是提高磁富集效率的有效有段。实现50 mL与1～1.5 mL分离体积相同的磁捕获效率，理论分析免疫磁珠用量需是小体积下的数十倍，因此按现有技术方案，大体积免疫磁分离方法的操作成本太高。本项目拟以Lm菌为分离模型，利用纳米免疫磁珠（100～200 nm）为磁捕获载体，从提高抗原/抗体反应效率，增加细菌表面纳米磁珠的结合数量等免疫学角度入手探讨降低大体积下免疫磁珠用量的理论依据，并结合数学建模的思想通过实验测试提出解决适合于纳米磁细菌快速分离的磁场设计方案，其最终目的为建立一套50 mL体积纳米免疫磁珠高效富集Lm以至其他食源性致病菌的免疫磁分离方法奠定理论基础。

食源性致病菌污染是我国食品安全的重大问题之一。目前检测食源性致病菌的“金标准”仍是传统的培养法。通常完成一次检测需要5～7d的时间，不能即时反馈检测结果。现有的分子生物学以及免疫学检测技术可替代传统培养法用于食源性致病菌的早期筛查与监测。但以上方法因检测灵敏度的限制，一般仍需 12～24 h 的前增菌过程。因此，如何有效地提高现有检测方法的灵敏度，缩短食品中致病菌的检测时间是建立快速筛查方法面临的共性科学问题。.免疫磁分离技术是食源性致病菌快速筛查技术的重要组成部分之一，该技术可高效捕获、浓缩增菌液中目标菌，提高致病菌检测灵敏度。现有的静态免疫磁分离方法因分离体积小（1～1.5 mL）而致富集效率低。增大磁分离体积是提高磁富集效率的有效有段。在大体系下若要实现与1～1.5 mL分离体积相同的磁捕获效率，需是消耗与小体积下数十倍的免疫磁珠用量，因此大体积免疫磁分离方法存在操作成本太高的理论缺陷。本研究针对以上问题，首先探讨了磁珠表面接枝长短对偶联抗体生物活性的影响，建立了大体系下的单增李斯特菌高效捕获方法，进一步依据二级抗体信号放大原理，以阳离子球形高聚物为载体，通过链霉亲和素-生物素体系建立了两步法磁信号放大系统，解决了大体系下的免疫磁分离抗体及磁珠用量大的共性问题。通过本研究的两步法磁信号放大系统，在10mL体系下，抗体使用量可降低20-30倍，磁珠用量可降低1倍。通过该技术改进，使本课题研究离产业化应用又进了一步。.在此基础上，本研究将大体积免疫磁分离与多重PCR方法结合，建立了检测生菜样品中单增李斯特菌以及绵阳李斯特的新方法，该方法检测生菜中LM灵敏度达到了10 CFU/g，总体检测时间不超过7h；将大体积磁分离方法与DLS方法结合，检测实际样本中LM最低检测限为22 CFU/g，检测时间不超过4h；将大体积免疫磁分离与等离子共振酶联免疫吸附法结合，检测蔬菜实际样品中单增李斯特菌灵敏度达到了8 CFU/mL。