单核细胞增生李斯特菌Hfq互作sRNA的发掘及其功能解析

Hfq蛋白和sRNA是人兽共患致病菌单核细胞增生李斯特菌中新发现的毒力调控因子，目前它们在LM生长代谢及毒力调控中的作用研究甚少。本研究首先采用免疫共沉淀方法，从野生株体外胁迫下培养物的总RNA中钓取sRNA，并利用RACE技术、Northern blot 和凝胶阻滞实验，对其cDNA序列、体外结合活性及表达丰度进行研究。然后采用蛋白质组学技术、Real-time PCR等分子生物学实验技术和免疫学实验技术，以sRNA突变株、hfq突变株和野生株为材料，通过体外胁迫培养、细胞感染和小鼠感染实验，对其表型特征、抗胁迫能力、毒力因子转录谱、差异蛋白表达及细菌致病力等进行深入研究，揭示与Hfq互作sRNA在LM对环境压力应答和致病性中的调控作用。本研究有助于阐明LM致病的分子调控机理，为抗LM感染提供新的药物靶标，为李斯特菌病的预防与控制奠定理论基础。

利用同源重组技术分别成功构建了单核细胞增生性李斯特菌EGDe菌株及NTSN菌株hfq基因的缺失株，对重组克隆用PCR方法和RT-PCR方法均证实靶基因被成功敲除，将阳性克隆命名为EGDe△hfq、NTSN△hfq。另外，将hfq基因及其启动子序列构建进pERL3质粒中，通过电转化的方法导入感受态细胞NTSN△hfq中，获得hfq基因回复株，命名为NTSN△hfq-hfq。对亲本株、hfq缺失株及回复株的生长曲线、生理生化特性、溶血活性进行了测定。实验结果表明，EGDe△hfq、NTSN△hfq的生长趋势与野生株相似，溶血活性未发生明显变化，但EGDe△hfq丧失α葡萄糖苷酶活性，NTSN△hfq丧失亮氨酸芳胺酶活性及乳糖氧化能力，表明hfq基因的缺失对细菌正常的生长未造成明显影响，但对碳源、氮源代谢途径中的特定代谢通路造成一定的影响。.通过体外胁迫培养、细胞侵袭和小鼠感染实验，对其表型特征、抗胁迫能力及细菌致病力等进行研究。实验结果表明：于4℃低温环境下，缺失株生长较野生株显著下降(p<0.05)，在含7% NaCl高渗BHI培养基及4.5%乙醇的BHI培养基中，缺失株生长受到明显抑制。此外， EGDe△hfq和NTSN△hfq对1% TritonX-100敏感性显著增加，在BHI、胆盐培养基中，缺失株形成生物膜的能力显著下降(p<0.05)，对Caco-2细胞系的侵袭能力降低。突变株对BALB/c小鼠的毒力测定结果表明，EGDe△hfq半数致死剂量比野生型菌株提高6倍，毒力显著降低，NTSN△hfq半数致死剂量比野生型菌株提高16倍，毒力显著降低。上述实验结果表明，Hfq蛋白对Lm抗胁迫、生物膜形成及细菌毒力具有重要的调控作用。. 利用同源重组技术敲除了5个snRNA,获得5株snRNA缺失的突变株。体外生长曲线测定结果表明，缺失株的生长曲线和野生株之间无显著性差异；，对巨噬细胞P388D1的侵袭实验结果表明，其中有2个突变株的侵袭率显著低于野生菌株EGDe。对小鼠的感染实验表明，缺失株在小鼠肝脏和脾脏中的细菌载量显著低于野生菌株。以上实验表明，这两个snRNA对单核细胞增生李斯特菌在体内的致病性发挥重要作用。. 缺失株的构建及其生物学特性的测定为进一步研究Hfq、snRNA的功能提供了材料，为研究其在Lm胁迫环境生存及疾病预防控制奠定了基础。