冰岛硫化叶菌新型ATP酶PINA的生化性质与结构及其在同源重组修复中的作用研究

DNA recombinational repair is one of the most important DNA repair pathways. Holliday junction (HJ) migration and processing are important late stage steps of this pathway. In bacteria, RuvABC complex functions in HJ migration and cleavage, in which RuvA and RuvB are ATPases and DNA translocases, while RuvC is a HJ-specific endonuclease. Resolvases from archaea and eukarya have been characterized recently, however the structural homolog of RuvAB have not been identified. Our preliminary studies revealed that the archaeal HJ resolvase Hjc interacted with a novel conserved ATPase named PINA in Sulfolobus. Genes encoding the two proteins are adjacent with short overlaps, indicating PINA may function in HJ processing as HJ migration as RuvAB. In his study, the biochemical properties of PINA, including ATPase, DNA binding and unwinding, HJ migration activities and the interaction between PINA and Hjc will be analyzed. The crystal structures of PINA will solved and the in vivo role of the protein will be investigated. It is expected that the study will clariy the function of the novel conserved ATPase in archaea and deepen our understanding of DNA recombinational repair in archaea.

同源重组修复是重要的DNA修复途径之一，Holliday junction (HJ)的迁移和处理是其后期的重要过程。细菌中HJ迁移和解离由RuvABC复合体共同完成，其中RuvA和RuvB为ATP酶和DNA移位酶，而RuvC为HJ特异性的核酸内切酶（称为HJ解离酶）。古菌和真核生物中的解离酶已相继被发现，但RuvAB结构类似物均未鉴定出来。我们的前期分析发现, 硫化叶菌中的HJ解离酶Hjc与一新型且保守的 ATP酶(命名为PINA)互作, 二蛋白编码基因在基因组中位于同一位点且相互重叠，暗示PINA可能参与HJ的加工，类似RuvAB。本研究将分析该新型ATP酶的生化性质包括ATP酶水解、DNA结合与解旋和HJ迁移等活性及其与Hjc的相互作用，解析PINA晶体结构，用遗传方法分析PINA在细胞内的重要性及作用，对该新型而保守的ATP酶进行功能定位，加深对古菌DNA重组修复机制的认识和理解。

Holliday junction (HJ)是DNA重组过程中的标志性中间产物，细胞必须对其拆分（dissolutioin, 对双HJ）或解离来维持基因组的稳定性。尽管三域中HJ 解离酶均已鉴定出来，但是寻找原核生物和真核生物中促使HJ迁移的蛋白一直是悬而未决的课题。本项目研究中，我们在冰岛硫化叶菌中发现、鉴定并报道了一种新的ATP酶，命名为PINA（PilT N-terminal-domain-containing ATPase)。该蛋白与解离酶基因hjc在基因组上比邻。PINA在所有古菌中均保守存在，遗传分析证明在冰岛硫化叶菌该蛋白基因对生长是必需的。和大肠杆菌杆菌中的HJ迁移酶RuvB一样，纯化的及在晶体中PINA蛋白呈现六聚体形态。结构分析提示ATP的结合和水解引起蛋白构象变化，从而驱动HJ分支的迁移。进一步的研究揭示PINA和Hjc存在物理上和功能上的相互作用，二者协调共同完成HJ的迁移和解离(Zhai et al., 2017)。. 接下来，我们利用亲和纯化和质谱鉴定方法，发现和鉴定了若干与PINA互作的蛋白，如Hjm和RfcS并加以证实。确认PINA 与 Hjm (Hel308a) 解旋酶具有直接的相互作用。发现Hjm, Hjc和PINA 能够协作完成HJ的迁移和切割。PINA羧基端13个氨基酸的缺失会导致SisPINA 与 Hjm间的相互作用丧失。解析了PINA单体全长的结构。证明PINA羧基端70 个氨基酸折叠形成一II型KH结构域。该类结构域在其它蛋白中起结合RNA和单链DNA的功能。该KH结构域不仅介导PINA 与 Hjm 和 Hjc 相互作用，也调节PINA聚集成六聚体。以上结果表明SisPINA, Hjm 和Hjc 在复制叉回退，HJ迁移和切割中一起发挥作用(Zhai et al., 2018)。. 此外，在本自然科学基金面上项目支持下，我们分析了硫化叶菌中蛋白磷酸化网络和磷酸化组学变化，研究了蛋白磷酸化对DNA修复酶的影响(Huang et al. 2017, 2019, 2020)。我们还对DNA无碱基核酸内切酶（AP endonuclease）和可能的DNA损伤响应蛋白LOG和进行了结构或功能分析 (Yan et al., 2017；Mayaka et al., 2019)。