α-1,3-葡聚糖在monophora着色霉慢性感染中的作用机制研究

Chromoblastomycosis is a chronic deep mycosis caused by dematiaceos fungi. The inactivation of Th1 plays key role in the chronic course of chromoblastomycosis, and the ineffective recognition between fungal pathogens and host may be its inner mechanism. Our former study showed that the shielding of β-1,3-glucan by α-1,3-glucan in the cell wall to evade immune recognition, which may be induce ineffective activation of pattern-recognition receptors and the pathogenic fungus cannot to be totally cleared by host immune cells, so the chronic course of chromoblastomycosis formed. In this study, we will construct the gene knock-out system of the new Fonsecaea species - F. monophora through knocking out the α-1,3-glucan encoding gene. Then we will use macrophage co-culture system to confirm that the ineffective activation of pattern recognition receptor - Dectin-1 is directly related to the shielding of β-1,3-glucan by α-1,3-glucan, and we will evaluate the influence of immune cell vitality and the key cytokines involved in the Th1,Th2 immune system. And then we will establish animal model to prove that the absence of α-1,3-glucan encoding gene will influence the pathogenicity of F. monophora and the Th1/Th2 immune balance of host. Finally we can confirm the molecular mechanism of α-1,3-glucan in the chronic infection of F. monophora.

着色芽生菌病是由暗色真菌引起的一种病程慢性的深部真菌病。Th1免疫激活不足是慢性病程的关键，而病原菌与宿主未能有效识别可能是其内在机制。我们前期实验表明着色霉新种F.monophora细胞壁α-1,3-glucan对β-1,3-glucan的屏蔽作用可能导致模式识别受体激活不足引起病原菌免疫逃逸，进而导致着色芽生菌病慢性感染形成。本项目拟通过靶向敲除α-1,3-glucan编码基因，利用巨噬细胞共培养证实模式识别受体Dectin-1激活不足与α-1,3-glucan对β-1,3-glucan的屏蔽作用直接相关，并检测其对免疫细胞活力的影响及Th1,Th2细胞激活关键因子的表达情况；动物模型进一步验证α-1,3-glucan编码基因缺失对F.monophora致病性及宿主Th1/Th2免疫平衡的影响，从而明确α-1,3-glucan在F.monophora 慢性感染中的作用机制。

着色芽生菌病（Chromoblastomycosis，CBM）是由暗色真菌引起皮肤和皮下组织慢性感染的深部真菌病，主要分布于热带及亚热带地区。2017年，该病首次被世界卫生组织（WHO）认为是“被忽略的热带疾病”。CBM病程长，治疗困难，复发率高，严重威胁患者身心健康。我国广东地区是CBM的高发区，主要流行菌株为Fonsecaea monophora。本研究以CBM为研究对象，主要包括三个内容：1. 构建F. monophora CRISPR-Cas9系统敲除α-葡聚糖合酶（alpha glucan synthase）体系。2.对我国南方25例患者的临床特征，流行菌株，体外药敏实验及患者血清因子表达谱进行总结分析。3. F. monophora感染Card9-/-小鼠的免疫病理机制研究。获得的主要研究结果如下：.1.完成了α-1.3-glucan编码基因的拼接、测序验证及相关抗体的western-blot筛选。CRISPR-Cas9系统敲除α-葡聚糖合酶体系已构建成功，利用根癌农杆菌介导的转染已显示出阳性荧光。.2.对25例CBM患者进行了归纳分析。明确了F. monophora 和F. nubica是广东省着色芽生菌病的主要流行菌株。首次提出F. nubica 可能引起更多的重度感染病例。体外药敏显示菌株对泊沙康唑，伏立康唑，伊曲康唑最敏感，其次为特比萘芬。18例患者的血清细胞因子芯片显示IL-4, IL-7, IL-15, IL-11和IL-17 在患者中表达上调, 而 IL-1RA, MIP-1β, IL-8, IL-16下调( p<0.05)。细胞因子谱的表达异常提示着色芽生菌患者免疫功能受损。 .3.成功构建了F. monophora感染Card9-/-小鼠足垫动物模型，小鼠足垫感染后逐渐出现肿胀、坏死、溃疡，组织病理中菌丝大量形成，菌载量显著升高。流式细胞术分析发现Card9-/-小鼠在感染早期招募中性粒细胞功能受损。Luminex分析提示Card9-/-小鼠局部免疫以非保护性的Th2免疫为主，而野生型小鼠以保护性的Th1，Th17免疫为主。这可能是Card9-/-小鼠形成持续性感染的主要免疫病理学机制。.本研究从患者，致病菌及基因缺陷小鼠实验三方面对CBM进行了研究，为后续的深入研究打下了良好的基础。