光遗传学控制病原菌Gac/Rsm基因回路活性方法的建立及其在致病性研究中的应用

Optogenetics is a technology that allows targeted, fast control of precisely defined events in biological systems by expressing exogenous genes coding for light-sensitive proteins. By delivering optical control at the speed (millisecond scale) and with the precision (exquisite spatial and temporal precision) required for biological processing, optogenetic approaches have opened new landscapes for the study of biology. However, in microbiology, the development of optogenetics is limited by the requirement of engineered light-sensitive proteins for specific regulation networks and new methods for manipulation of living bacterial cells at the single-cell level. Here, we intend to establish an optogenetic approach to study the pathogenicity of Pseudomonas aeruginosa by combining multidisciplinary research methods of synthetic biology, optogenetics, microscopy, etc. The approach includes the design and engineering of photo-sensitive protein for regulation of the Gac/Rsm cascade, which is of central importance for the regulation of pathogenicity in P. aeruginosa, and the development of micromanipulation method at the scale of single cell manners. Afterwards, we will apply the established optogenetic approach to the basic research related to pathogenicity of P. aeruginosa, including the spatio-temporal manipulation of T6SS toxin activity for cell killing and competition study, and manipulation of bacterial infection ability for host-infection study. These studies will help us to uncover the infection strategy and pathogenic mechanism.

光遗传学通过引入光敏基因，可以实现光信号对细胞生理状态的精确控制。相比传统生物技术，光遗传学有着无可比拟的优点：微创、精准和独特的高时空分辨率。在微生物研究领域，光遗传学技术的发展受限于开发新的光敏蛋白以适用于不同研究，和开发高精度的显微操作技术以实现单细胞水平上的细菌操纵。在本研究计划中，我们拟通过建立新的方法将光遗传学技术应用到铜绿假单胞菌的致病性研究中。我们首先从方法学出发，结合合成生物学、光遗传学、显微光学等多学科交叉的研究手段，针对其致病性的核心调控回路Gac/Rsm，给出从最初的光感受体设计、构建，到实现单细胞尺度上原位操纵细菌的光遗传学方法建立的整体解决方案。然后将建立的方法应用于铜绿假单胞菌致病相关的基础研究中，包括实现对毒力因子和细菌感染能力的时空操控，进行细菌侵染细胞和感染宿主的光遗传学研究。最终通过探索细菌的侵染和感染策略，为治疗铜绿假单胞菌感染提供新的思路。

光遗传学将光学和遗传学结合，是一种利用光操控生命过程的新兴技术。与传统的基因调控手段相比，光遗传学调控具有无可比拟的优势，它可以实现精准、低毒性、高时空分辨率的调控。因此，光遗传学技术成 为了生物学研究的重要手段，广泛应用于神经元操控，基因编辑、生物打印、疾病治疗等许多生物学领域。.病原菌致病性研究一直是微生物基础研究的一个重点，它与人类健康密切相关。开发和建立新的细菌致病性研究的方法将具有重要意义。在本研究中，我们将光遗传学技术引入到病原菌 铜绿假单胞菌的致病性研究中开发了对其致病性相关回路进行精准光调控的新方法。并且，将此方法引入到秀丽隐杆线虫宿主模型中为研究宿主-病原菌相互作用提供新的工具 。.我们首先针对铜绿假单胞菌的GacS-GacA双组分系统进行光遗传学改造。GacS-GacA系统 是 具有全局调控能力，是细菌 生活方式和急慢性致病模式转变的关键调节子，显著影响着细菌毒力的表达。我们将 LOV光感受器与 组氨酸激酶GacS的效应模块进行融合，改变了 GacS的输入信号特异性，得到了蓝光激活的YGS24蛋白。YGS24受光能使反应调节蛋白 GacA发生可逆磷酸化，从而改变铜绿假单胞菌的毒力表达和致病机制。 为了探索宿主与病原菌之间的相互作用，我们引入了铜绿假单胞菌-秀丽隐杆线虫的宿主-病原菌模型。在“缓慢杀戮”和“致命麻痹 两种致病模型中，均实现了细菌对宿主致病能力的光调控。在此基础上，我们结合微流控技术和显微镜技术，实现了对线虫肠道内铜绿假单胞菌致病能力的原位光诱导和实时观察。.综上，我们开发的YGS24-GacA感光双组分系统，扩充了光遗传学的工具箱，并将成为研究 细菌致病性和宿主-病原菌相互作用的有力工具，有助于扩展人们对细菌感染机制的认知和开发新的治疗方法。