ALOX5AP基因启动子区CpG-SNPs与DNA甲基化互作对缺血性脑卒中易感性的影响

Abstract: Ischemic stroke (IS) is a nervous system disease of high fatality rate and disability rate and has become the No.1 human health killer. The new research has reported that the SNPs which are located on the CpG island of gene promoter, namely CpG-SNPs, can add or remove the specific CpG sites and then affect the DNA methylation level, which regulate the interaction of genetics and epigenetics and affect the potential mechanism of gene expression. Our previous work proved that the key SNP（ rs17222919）of ALOX5AP gene promoter associated with IS apparently(P=0.004), which might participate in the IS onset process. Therefore, this project intends to use RT-PCR, bisulfite sequencing PCR(BSP) and TaqMan-PCR typing to study: 1) the differences of methylation levels of ALOX5AP gene promoter between the IS group and control group and the relationships between methylation level of ALOX5AP gene promoter and mRNA expression level; 2) the interaction between CpG-SNPs of ALOX5AP gene promoter and DNA methylation; 3) the influence of CpG - SNPs to the transcriptional regulation and control function by using the Dual luciferase reporter gene experiment. This study will reveal the pathogenesis of IS and its characteristics from a new angle of genetic, epigenetic and their interaction, and provide the theoretical basis for pathological mechanism of IS.

缺血性脑卒中（IS）是致死率、致残率极高的神经系统疾病，已成为危害人类健康的头号杀手。最新研究报道，位于基因启动子区CpG岛上的CpG-SNPs，可以通过改变CpG位点影响DNA的甲基化水平，具有调节遗传与表观遗传互作进而影响基因表达功能的潜在机制。我们的系列研究表明：ALOX5AP基因启动子区关键SNP(rs17222919)与IS显著相关（P=0.004），可能参与IS的发病过程。因此，本项目拟采用实时定量RT-PCR技术、亚硫酸氢钠测序(BSP)技术、及TaqMan-PCR分型等技术深入研究：1）ALOX5AP基因启动子区甲基化水平与mRNA表达水平之间的关系；2）ALOX5AP基因启动子区的CpG-SNPs与DNA甲基化是否存在交互作用；3）采用双荧光素酶报告基因实验分析CpG-SNPs对转录调控功能的影响。本研究将从遗传、表观遗传以及其交互作用的新角度揭示IS的发病机制。

缺血性脑卒中（IS）是致死率、致残率极高的神经系统疾病。有文献报道位于ALOX5AP基因启动子区CpG岛上的CpG-SNPs，可通过改变CpG位点影响DNA的甲基化水平。因此，本项目旨在探究ALOX5AP基因启动子区遗传与表观遗传及其互作进而影响缺血性脑卒中易感性的机制。.方法：1、SNaPshot多重微测序技术分析ALOX5AP基因启动子区SNPs及单倍型与IS的相关性，对阳性位点rs17222919扩大样本量验证，双荧光素酶报告基因研究其对转录调控的影响。2、MethylTarget目的区域甲基化测序检测基因启动子区甲基化水平，分析其与mRNA表达水平之间的关系；3、KASP基因分型技术对CpG-SNP进行基因分型，分析基因启动子区的CpG-SNPs与DNA甲基化交互作用；4、RT-PCR技术与双荧光素酶报告基因的实验分析miRNA对该基因的转录后调控。.结果：1、IS组9个SNPs位点组成的TACCATTGG单倍型频率高于对照组（P﹤0.01，OR=2。282，95%CI：1.076-4.841），IS组rs17222919位点G等位基因的频率低于对照组，（P﹤0.01，OR=0。782，95%CI：0.668-0.915）。GG型的荧光素酶活性低于TT型（P=0.031）；2、ALOX5AP基因在IS组中的表达水平高于对照组（P﹤0.05），两组间的总体甲基化程度无显著差异（P﹥0.05）；3、rs4073259位点GG基因型个体ALOX5AP基因的甲基化、mRNA表达水平低于AG和AA基因型个体，且G等位基因的荧光活性低于A等位基因（P﹤0.05）；4、miR-335、miR-495在IS组患者血浆中的的表达水平降低（P﹤0.05），其可结合该基因3’UTR区。.结论：1.TACCATTGG是河南汉族人群IS发病的风险单倍型。rs17222919T﹥G位点对IS的发生具有保护作用，且rs17222919位点的G等位基因对ALOX5AP基因的转录活性具有抑制作用。2、ALOX5AP基因在IS组和对照组中的表达差异并非由其启动子区甲基化差异造成；3、该基因启动子区CpG-SNP位点rs4073259通过ASM影响了该基因的表达，影响疾病的表型；4、IS病例组外周血血浆中低表达的miR-335、miR-495通过结合ALOX5AP基因的3’UTR区调控该基因表达