基于数字编码悬浮芯片的免疫T7-RNA聚合酶扩增对细胞因子的多组分高灵敏分析研究

Proteins are key regulators in various physiological and biological processes in vivo and important biomarkers in disease initiation and progression. Thus, it is of great importance for high-throughput and high sensitive analysis of proteins, not only for eluminating their biological functions but for disease dignotics and treatment. However, there are a wide variety of proteins (~ 100,000 species) with the vast majority at low amount in organsms (< pM). Traditional analytical techniques such as ELISA are limited by detection sensitivity, although applicable for throughput analysis. In contrast, the recent developed techniques based on nanomaterials, digital platforms and DNA nanotechnology, are short of the capablity for throughput analysis, although with sensitivity greatly improved. To overcome the difficulty in compatibility between analytical throughput and detection sensitivity, we intend to establish an novel analytical platform of Immuno-detection amplified by T7 RNA polymerase (IDAT) based on graphic coding suspension chip. With cytokines selected as representatives, the platform is promising for the highly sensitive and multiplex proteins analysis, by taking advantages of the fabricated graphic coding suspension chip such as simple to encode, easy to decode and with strong parallel analysis capability, as well as the IDAT technique which is highly efficient, easy to operate and conveninent for combining with the suspension chip, and a more specific IDAT amplification to be developed based on proximity ligation assay (PLA). The platform is further potential to be extended to other trace protein analysis, which is of great value for the systematic and large-scale proteomics research, biomarker identification, drug screening and clinical applications.

蛋白质作为生物体内各类生命功能的调控者和关键的生物标志物，对其开展高通量高灵敏分析具有极为重要的价值。但蛋白种类繁多（~ 10万种）含量很低（< pM），常规分析虽能通量检测，却受限于灵敏度；而最近发展的纳米材料，数字化平台和DNA纳米技术，虽能极大的提高灵敏度，但却难以通量分析。针对检测通量和灵敏度难以兼容的问题，我们拟建立基于图形编码悬浮芯片的免疫T7 RNA聚合酶扩增（IDAT）分析平台。这一平台利用编码简单，解码方便，具备强大并行分析能力的图形编码悬浮芯片，结合IDAT扩增效率高，操作简便且易于与悬浮芯片融合的特点，及拟发展的依赖邻近连接反应（PLA）的IDAT扩增的高特异性，以细胞因子作为蛋白分析的代表，有望实现蛋白的多组分高灵敏分析。该平台可进而拓展至其他痕量蛋白的分析，这对于系统大规模的蛋白质组学的研究，生物标志物鉴定，药物筛选及临床应用等都具有非常重要的意义和价值。

蛋白质作为生物体内各类生命功能的调控者和关键的生物标志物，对其开展高通量高灵敏分析具有极为重要的价值。但蛋白种类繁多（~ 10万种）含量很低（< pM），常规分析虽能通量检测，却受限于灵敏度；而最近发展的纳米材料，数字化平台和DNA纳米技术，虽能极大的提高灵敏度，但却难以通量分析。针对检测通量和灵敏度难以兼容的问题，我们建立了两套分析系统，分别为基于图形编码悬浮芯片的免疫T7 RNA聚合酶扩增（IDAT）分析平台和基于图形编码悬浮芯片的依赖临位连接反应的IDAT分析平台。. 以细胞因子作为蛋白分析的代表，前一平台利用核酸蛋白偶联探针，将细胞因子的识别转化为核酸的检测，利用IDAT扩增效率高，操作简便且易于与悬浮芯片融合的优势，结合编码简单，解码方便，具备强大的并行分析能力的图形编码悬浮芯片，实现蛋白的多组分高灵敏分析，对四种细胞因子（TNF-α, IFN-γ，IL-7，IL-15）的灵敏度可达 0.1 pg/mL，线性范围可达 4 个数量级（0.1 pg/mL- 1000 pg/mL）。. 同时，我们利用临位连接反应，制备了两条核酸蛋白偶联探针，将细胞因子的识别转化为核酸片段的连接，通过连接探针的设计，可有效提高分析的特异性。在此基础上，利用IDAT扩增效率高的优势和具备强大的并行分析能力的图形编码悬浮芯片的优势，实现了蛋白的多组分高灵敏分析，对四种细胞因子（TNF-α, IFN-γ，IL-7，IL-15）的灵敏度可达 0.01 pg/mL，线性范围可达5个数量级（0.01 pg/mL- 1000 pg/mL）。相比于 IDAT 扩增平台，依赖 PLA 的 IDAT 平台可进一步提高特异性，从而提高了分析的灵敏度，比 IDAT 平台的效果有了明显的提高。. 最后，我们将依赖PLA的我们将所开发的依赖 PLA 的 IDAT 平台用于实际样品如血浆，血清的分析，们对四个实际样品中的四种细胞因子（TNF-α, IL-6，IL-7， IL-15）均可有效检出，表明我们的方法具有非常好的稳定性和抗干扰能力，能有效用于实际样品的分析。. 该平台有望拓展至其他痕量蛋白的分析，这对于系统大规模的蛋白质组学的研究，生物标志物鉴定，药物筛选及临床应用等都具有非常重要的意义和价值。