siRNA复合物胶束的稳定结合与触发释放的聚合物分子结构调控及内涵体逃逸机制研究

The objectives of the proposal are to study the dilemma of the siRNA complex micellar stability and intracellular release as well as the mechanism of the copolymer facilitated endo-lysosomal escape. The amphiphilic mPEG-PLA-pHis-ss-PEI- g-guanidinium copolymers are applied for investigating the association and dissociation of the siRNA complex micelles by manipulating the hydrophobic block length of PLA, pH responsive block of pHis,electrostatic binding block of PEI-g-guanidinium and hydrophilic block of mPEG that creating different hydrophobic force, electrostatic force and hydration conditions. The molecular regulation mechanisms underlying the binding of siRNA to the cationic polymer and the triggered release of siRNA from the complex micelles are elucidated. The copolymer facilitated siRNA endo-lysosome escape is studied to demonstrate the seperated and the synergistic role of "proton sponge" effect, guanidium mediated endo-lysosomal membrane fusion and PEI mediated endo-lysosomal membrane destabilizing effect in the siRNA endo-lysosomal escape.The effect of bidentate hydrogen bonding of guanidium on the affinity of PEI and the following membrane fusion to endo-lysosomal membrane are also elucidated using PEI with different graft degree of guanidinium.

本项目针对siRNA复合物递送系统中二者稳定结合与细胞内释药的矛盾和siRNA的内涵体/溶酶体逃逸机制展开研究。设计并合成嵌段共聚物mPEG-b-PLA-b-PHis-ss-PEI-g-guanidinium，通过调节共聚物分子结构中各嵌段的长度，研究共聚物分子中疏水嵌段（PLA）、pH敏感嵌段（PHis）、静电结合嵌段（PEI-g-guanidinium）和亲水嵌段（PEG）的疏水作用、静电作用和水化作用对共聚物与siRNA结合与解离行为的影响，揭示siRNA复合物胶束稳定结合与触发释放的分子结构调控机制。采用系列共聚物研究“质子海绵”效应、胍基介导的膜融合与PEI介导的膜结构破坏作用三种不同机制在实现siRNA内涵体/溶酶体逃逸行为中的单独与协同作用，同时揭示胍基介导的二齿氢键作用对阳离子PEI与内涵体/溶酶体膜融合过程的影响。

目前，在siRNA载体递送的过程中，影响siRNA递送效率最主要的因素包括：siRNA复合物在血液循环中的稳定性、siRNA从载体中的有效释放以及细胞中的内涵体逃逸。本项目对pH敏感共聚物单甲氧基-聚乳酸-聚组氨酸（mPEG-PLA-PHis）进行化学修饰，在其末端组氨酸结构中通过二硫键引入阳离子嵌段PEI,设计一种具有pH和氧化还原双重刺激响应性的聚合物mPEG-PLA-PHis-ss-PEI 1.8k。该聚合物以期望可以解决以下科学问题：通过整合疏水嵌段疏水作用力和静电结合作用力与siRNA结合形成稳定的复合物，并在血液循环中保持稳定；能够响应肿瘤细胞微环境中的酸性和氧化还原性等刺激因素，触发复合物结构的转变及二硫键的断裂，从而促进siRNA分子从胶束复合物中解离并释放；结合PEI和聚组氨酸的质子海绵作用与PEI的内涵体膜结构的破坏作用，协同促进siRNA分子有效的早期内涵体逃逸。合成了pH刺激响应性触发释放的聚合物mPEG-PLA-PHis-ssPEI 1.8 k。通过红外分光光度法（FT-IR）、核磁共振氢谱法(1H-NMR)、质谱法（MS）以及凝胶渗透色谱法（GPC）对聚合物及各中间产物的结构进行了表征。通过琼脂糖凝胶电泳法、荧光分光光度法和动态光散射法对不同N/P的胶束复合物进行考察，合成的聚合物在N/P 3以上时，可以较好的结合siRNA，形成完整的复合物，包封率均在89%以上。胶束复合物的粒径和zeta电位均具有N/P比依赖性。在pH 5.5 和 10 mM DTT条件下复合物胶束快速释放siRNA。N/P 6的胶束复合物其FRET效率显著低于N/P 10和N/P 15的胶束复合物，表明N/P 6的胶束复合物具有良好的细胞内触发释放siRNA的能力。显示高N/P的胶束复合物产生的Bcl-2蛋白沉默效率和荧光素酶沉默效率显著低于N/P 6的胶束复合物。胶束复合物在荷瘤裸鼠体内表现出更强的肿瘤靶向性和更缓慢的肝肾清除，三种不同N/P比例的胶束复合物并未表现出明显差异。荷瘤裸鼠药效学实验显示，三种不同N/P比例的胶束复合物给药后，对肿瘤的生长均有抑制作用。与N/P 10 和N/P15的胶束复合物相比，N/P 6的胶束复合物具有更好的肿瘤抑制作用和更高的Bcl-2蛋白下调率。