靶向肿瘤树突状细胞的还原触发型siRNA共轭物胶束的设计及其分化调控

肿瘤生物治疗是近几年的研究热点。采用特异性小分子干扰RNA(siRNA)可阻断肿瘤免疫微环境中树突状细胞（DC）前体的相关信号途径及受体表达，从而影响分化结局，但siRNA对DC的导入是关键。本项目以基因载体的高效、低毒为目标，以解决其胞外突释和胞内不完全释放为着力点，通过肿瘤微环境中DC胞内还原剂触发下断裂的敏感键（二硫共轭键）的引入，合成siRNA-PLGA共轭嫁接物，可自主形成基因-聚合物胶束。另将DC靶向的甘露糖化壳寡糖，通过聚电解质作用，与胶束一起构建成含多功能组分的基因载体并表征。体内外评价其释放特征、转运效率、基因和载体的胞内分布。最终，将经过siRNA干扰处理的DC前体细胞注入荷瘤鼠，观察其在肿瘤微环境中的分化结局，为肿瘤免疫治疗提供新的方法和有效途径，也为DC疫苗的合理构建提供理论基础。

设计高效、稳定、安全的基因载体对增强基因治疗药物的疗效具有重要意义。本项目制备了基于二硫键的siRNA-PLGA/CSO共轭物胶束，并对其制剂学特征，RNA酶中的稳定性、细胞摄取率、基因沉默效率、细胞增殖和凋亡等进行了评价。制备了二硫键敏感的壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶束，优化基因给药系统处方，考察载体毒性、 DNA酶中的稳定性、生物稳定性及靶向性，动物体内进行基因疗效评价。构建了壳寡糖基因纳米给药系统并考察其理化性质，细胞毒性及细胞摄取率。产妇脐带血中分离纯化得到mDC前体细胞，检测Notch1受体及配体在DC前体细胞中的表达及下调Notch1表达在卵巢癌微环境中对DC前体细胞体外分化的影响。. 本项目完成的重要结果：成功合成了siRNA-PLGA共轭物胶束，其CMC值为3mg/L，粒径为205nm，电位为-43.5mV。siRNA-PLGA/CSO胶束（N/P=80）的粒径为150nm，电位为39.4mV，胶束为类圆形。siRNA-PLGA/CSO胶束（N/P=80）的细胞摄取率为91.92%。此纳米胶束系统对STAT3 mRNA以及蛋白表达具有明显抑制作用，其2-ΔΔCt值为0.22，蛋白表达为33.32%，显著低于阴性对照。胶束能显著抑制细胞增殖并促进细胞凋亡。CSO-SA/DNA (N/P=9.6)胶束的粒径为135.6nm，表面电位为6.4mv，在pH7.4环境中为类圆形。胶束细胞毒性是脂质体的1/50，对DNA具有保护作用。动物实验结果表明胶束基因治疗组与阳性对照组治疗效果无显著性差异。载DNA壳寡糖纳米给药系统粒径小于200nm，电位为40mV，可有效结合DNA，细胞毒性小，能快速进入细胞并靶向分布到细胞核，到达基因药物发挥作用的靶部位。在DC前体细胞中，检测到Notch1受体及其配体Jagged 1、Jagged 2、Delta 1 mRNA的表达。其中Notch1受体，Jagged 1高表达，Jagged 2，Delta 1低表达。采用shRNA-Notchl慢病毒转染后，检测到DC前体细胞中Notchl mRNA 的表达显著下降。流式细胞术检测Notch1表达下调的DC前体细胞的分化情况，与空白相比，shRNA慢病毒转染后DC前体细胞向mDCs的分化增多，向pDCs的分化减少。