靶向运载Ngn2诱导星形胶质细胞转分化为神经元：促进缺血性脑损伤后神经功能恢复的新策略

Ngn2 is an important neuronal transcription factor which could promote astrocytes transdifferentiate into functional neuron. This was demonstrated in vitro by transfecting Ngn2 gene into astrocytes. However, due to the restriction of gene transfection method, it is difficult to be used in clinical application and in vivo study. We have expressed several proteins and accumulated rich experiences for the future research in Ngn2. Our aim is to achieve the following tasks. 1) To express and purify Ngn2 in E.coli, which is modified by TAT-LBD structural domain and leads directly to cerebral ischemia area. 2) To verify that TAT-LBD-Ngn2 could transdifferentiate astrocytes into functional neuron, using Immunofluorochemistry method, live cell station and patch clamp technique. 3) To demonstrate that TAT-LBD-Ngn2 could not only cross blood-brain barrier effectively but also gather and target specifically in cerebral ischemia area after intravenous injection in the MCAO model. TAT-LBD-Ngn2 could promote astrocytes transdifferentiate into functional neuron and improve the recovery of motor function through neurothology. This research will definitely open up a new method of treating ischemia brain injury and provide experimental evidence in developing TAT-LBD-Ngn2 into a new and effective drug.

Ngn2是重要的神经转录因子，可以促进星形胶质细胞转分化为功能性神经元。但目前仅限于将其基因转染到星形胶质细胞，诱导分化为神经元的体外研究，由于受到基因转染方法的限制，很难用于体内研究和临床应用。基于我们前期多种蛋白的研究经验，我们的目标是：1）通过原核细胞表达纯化获得TAT-LBD结构域修饰的、可以靶向脑缺血区的Ngn2神经转录因子蛋白TAT-LBD-Ngn2；2）分别采用细胞免疫荧光化学、活细胞工作站、膜片钳技术验证TAT-LBD-Ngn2可以将星形胶质细胞转分化为功能性神经元；3）在大脑中动脉缺血损伤模型（MCAO）中，证实静脉注射该转录因子蛋白后既可以高效穿过血脑屏障又能够特异靶向聚集于脑缺血区，可以促进星形胶质细胞分化为功能性神经元并促进神经运动功能的恢复。为治疗脑缺血损伤的研究开辟新的治疗方法，也为将TAT-LBD-Ngn2开发为新的、有效的药物提供实验依据。

第一部分 可溶性TAT-LBD-Ngn2融合蛋白的构建、原核表达及纯化。在本研究中我们成功构建了一种新的Ngn2表达载体。该载体同时融合两个功能结构域：一个是具有穿过血脑屏障的功能结构域反式转录激活因子（Transactivator of transcription ，TAT），一个是可以靶向富集于脑缺血损伤区的层粘连蛋白结合域LBD（Laminin-binding domain, LBD），我们将其命名为TAT-LBD-Ngn2。利用高效的可溶性原核表达系统表达，获得了可溶性TAT-LBD-Ngn2融合蛋白。与此同时，我们还在体外对该蛋白的生物安全性做了评估，结果发现其对培养的神经元细胞无明显毒副作用。得到了上述结果后我们进一步在体内检测该蛋白的生物活性，发现在体内TAT-LBD-Ngn2蛋白可以高效的穿过血脑屏障并富集于大脑缺血区域并与该区域的神经细胞结合，上述结果为我们下一步将要进行的实验提供了科学依据。.第二部分 可溶性TAT-LBD-Ngn2融合蛋白促进星形胶质细胞转分化为神经元的研究。结果：加入蛋白培养后的星形胶质细胞由典型的星形胶质细胞形态逐渐向神经元样转变,。细胞免疫荧光化学法在7d、14d，28d观测加入TAT-LBD-Ngn2培养的星形胶质细胞及对照组细胞，发现在7d时βⅢtublin、MAP2即有少量表达，在14d时βⅢtublin、MAP2的表达达到高峰，但在28d时阳性率没有进一步升高。接着，在14d时细胞免疫荧光法观察到CaMkinase Ⅱα、vGluT1同样也有明显表达。.结论：之前的实验成功的表达了TAT转导的包含LBD功能域及Ngng2转录因子融合蛋白的基础上，本研究发现体外培养的星形胶质细胞在加入单一融合蛋白TAT-LBD-Ngn2后，成功的将星形胶质细胞诱导转分化为功能性神经元。这为今后在体内更近一步的研究TAT-LBD-Ngn2在对大脑缺血损伤保护及修复的机制开启了良好的实验基础。.第三部分 可溶性TAT-LBD-Ngn2融合蛋白对脑缺血损伤保护作用及机制研究。结论：TAT-LBD-Ngn2蛋白可以在短期内明显的降低大脑皮层缺血在灌注损伤区域细胞的退变与凋亡，降低损伤的梗死灶体积，从而起到了在短期内改善缺血再灌注损伤后的神经及运动功能恢复水平。并且，该蛋白还可以显着改善BCCAO小鼠长期的空间学习和记忆功能。