水泡口炎病毒基质蛋白和beta防御素-2协同增强抗肿瘤免疫效应研究

In our previous study ,the vesicular stomatitis virus Matrix protein plasmid complexed with actionic liposome showed a remarkable antitumor activity in various tumor models both vitro and in vivo，and the relevant results have been published in many research papers, such as FASEB Journal（2008）. To furthermore improve its anti-tumor effect of the M protein, break down the antitumor immune tolerance and enhance antitumor immune response, we will clone the vesicular stomatitis virus Matrix protein and beta-defensin-2 DNA into the eukaryotic expression vector pVitro2-neo-mcs for high levels of coexpression to investigation of the combined anti-tumor activity in vitro and in vivo.Many previous study has showed the beta-defensin-2 can induction of immature dendritic cells to mature and chemotaxis. So next we will investigate anti-tumor role of the eukaryotic co- expression plasmid and the the antitumor mechanisms, then we given its import system targeting by modified PEI with folic acid encapsulate the plasmid. The M protein and abeta-defensin-2 coexpression plasmid first enrich in folate receptor-rich tumor cells, reduce the expression of M protein in non-tumor cells, better play the M protein and beta-defensin-2 anti-tumor effect and reduce side effects, while enhance the body's anti-tumor immunity reaction. So our study will provide a new ideas and approach for targeted cancer gene therapy.

我们前期研究发现水泡口炎病毒基质蛋白（VSVM）核酸疫苗具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，并能激活细胞毒性T淋巴细胞诱导一定的抗肿瘤免疫反应，这种作用可能由于其诱导细胞凋亡而释放肿瘤抗原所产生，对多种肿瘤均具有良好的抗肿瘤活性，相关研究结果已发表多篇论文，首篇研究论文发表在FASEB J 2008。为了进一步增强M蛋白的抗肿瘤效果，增强机体抗肿瘤免疫反应，我们将具有趋化作用和诱导幼稚树突状细胞成熟的beta防御素2与M蛋白联合，构建真核共表达质粒（pVITRO2-VSVM-BD2），使M蛋白、beta防御素2能在肿瘤细胞内同时表达，通过细胞学实验和动物模型研究，探讨M蛋白与beta防御素2的协同抗肿瘤作用和作用机制，以更好的发挥M蛋白和beta防御素2的抗肿瘤效果，降低毒副作用，增强机体的抗肿瘤免疫反应，为肿瘤治疗研究提供新思路和新方法。

水泡口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV) 中基质(Matrix protein,M)蛋白在多种肿瘤模型中都表现出明显的抗肿瘤作用，防御素是天然免疫的重要分子，β防御素2具有促进主动免疫产生的能力。本课题首先构建了含有VSVM蛋白基因及小鼠beta防御素2片断 (murine beta defensin 2, MBD2)的pVSVM、pMBD2、pVSVM-MBD2重组质粒，经酶切、RT-PCR、测序鉴定基因插入正确。采用Lipofectamine 2000进行COS7细胞、小鼠结肠腺癌CT26及小鼠肺癌LL/2细胞转染，RT-PCR、western blot检测了M蛋白及beta防御素2的表达情况。体外细胞学实验中，MTT分别检测了pVSVM、pMBD2、pVSVM，pMBD2双质粒共转染及pVSVM-MBD2双表达质粒转染的CT26及LL/2细胞，这两种细胞生长均受到一定程度抑制，pVSVM-MBD2转染组对细胞生长抑制作用最为明显，细胞存活率显著降低。转染48h后，PI染色的细胞可以观察到典型的细胞凋亡时核的改变。流式细胞术定量检测各组细胞凋亡情况，pVSVM-MBD2转染组CT26和LL/2细胞凋亡率高达45.61%和 57.78%。此外，验证了VSVM和MBD2融合后仍保留了BD2趋化DC的活性。在动物实验中，建立BALB/c小鼠结肠癌（CT26）和C57BL/6小鼠Lewis肺癌（LL/2）动物肿瘤模型，进行抗肿瘤作用研究。pVSVM、pMBD2、pVSVM+pMBD2双质粒及pVSVM-MBD2对小鼠肿瘤均具有明显的抗瘤效应，pVSVM-MBD2 表现出更强的肿瘤效应。Cr51释放试验观察到pVSVM、pMBD2、pVSVM+pMBD2双质粒及pVSVM-MBD2治疗组的脾细胞均产生了明显的肿瘤细胞特异性的CTL活性，且这种杀伤活性能够被抗CD8+和MHC-I类单抗阻断，但不能被抗CD4+和MHC-II单抗阻断，pVSVM-MBD2呈现出更强效应。证明淋巴细胞过继实验也证实抗肿瘤免疫反应主要依赖于CD8+T 淋巴细胞。.我们的研究首次联合VSVM基因与MBD2基因用于肿瘤基因治疗，经pVSVM-MBD2处理，可观察到明显的肿瘤细胞凋亡，肿瘤生长抑制，且荷瘤小鼠的生存时间延长，同时激发较单基因更强的抗肿瘤免疫反应。因此