tPA通过GABA能突触传递介导的ERK-MSK通路激活视皮层可塑性的研究

视皮层可塑性在关键期终止后被抑制是大龄弱视难以治愈的原因，再激活可塑性是解决问题的关键。既往文献结合我们的前期研究发现：视皮层tPA通过降解神经元周围网络（PNNs），进而阻碍GABA能抑制性突触传递功能的发育成熟，激活视皮层可塑性。组蛋白乙酰基化通过控制相关基因表达再激活视皮层可塑性，ERK-MSK通路对组蛋白乙酰基化有调控作用。那么，GABA能突触传递是否通过ERK-MSK通路影响组蛋白乙酰基化水平，从而激活视皮层可塑性呢？因此，我们提出假说：视皮层tPA-PNNs-GABA通过激活ERK-MSK信号传导途径，引起细胞内染色质组蛋白乙酰基化水平提高，从而开启可塑性的基因转录，再激活关键期后被抑制的可塑性。我们拟采用基因转染和siRNA技术，借助脑片膜片钳全细胞记录、免疫荧光、整体电生理等方法，探讨tPA在视皮层可塑性被抑制后再激活中的作用机制,为探索弱视的发病机制奠定实验基础。

首先从在体、离体两种途径，研究了tPA对PNNs、GABA神经元回路表达及其突触传递功能的影响。在体观察了出生后的Long Evans大鼠视皮层tPA与PV、PNs三者发育性共表达的关系及其与视皮层发育可塑性的相关性，发现：1.tPA+PNs阳性细胞密度随发育的变化和大鼠视皮层可塑性关键期的变化基本保持一致，提示此类神经元与可塑性的关系密切，而tPA+PV和PV+PNs阳性细胞在成年期富集提示这两类细胞可能与关键期终止后可塑性的抑制有关；2.我们首先发现了tPA+PV+PNs阳性细胞的存在，此类神经元在可塑性高峰期富集提示被PNs包绕的具有分泌tPA功能的PV阳性神经元可能与关键期可塑性的增强有关。离体研究方面，观察了硫酸软骨素蛋白多糖（CSPGs）对γ－氨基丁酸（GABA）能神经元表达及其抑制性突触传递功能的影响，发现：CSPGs被成功降解后，GABA能神经元细胞密度、自发性微小性抑制性突触后电流（mIPSCs）幅度和频率均显著低于正常对照组，提示: CSPGs能促进GABA能神经元表达及其抑制性突触传递功能的成熟， 这可能是CSPGs抑制视皮层可塑性的作用机制之一。另外，体外观察了组织型纤溶酶原激活剂(tPA)对GABA能神经元表达及其抑制性突触传递功能的影响，发现：tPA被成功抑制后，GABA能神经元细胞密度、自发性抑制性突触后电流（sIPSCs）及mIPSCs的幅度和频率均显著高于正常对照组（P〈0.05）；tPA作用增强后的sIPSCs的幅度和频率及mIPSCs的幅度均显著低于正常对照组（P〈0.05），提示：tPA能抑制GABA能神经元表达及其抑制性突触传递功能的成熟，这可能是tPA参与视皮层突触发育可塑性的作用机制之一。.其次，构建了AAV-tPA过表达载体和AAV-tPA-siRNA抑制表达载体，但AAV-tPA-siRNA抑制效率低予以淘汰。建立了在体视皮层AAV-tPA局部注射模型，目前应用VEP眼优势柱分析法检测tPA对视皮层可塑性的影响。.最后，发现：在成年动物暗饲养视皮层可塑性再激活模型，其视皮层tPA阳性神经元细胞密度较正常组显著增加，GABA能神经元突触传递系统的发育较正常组显著幼稚化，tPA蛋白含量及蛋白水解活性均较正常组显著升高。正在检测该模型中视皮层ERK、MSK蛋白表达水平、染色质组蛋白H3、H4的乙酰基化水平。