基于可控基因与环境扰动的毕赤酵母合成S-腺苷甲硫氨酸系统代谢工程研究

S-腺苷甲硫氨酸（SAM）是广泛存在于细胞内的重要代谢物，也是具有广阔市场前景的治疗肝炎和抑郁症药物。在毕赤酵母中强化SAM合成酶（MAT）表达可获得SAM高产菌。但在反应器规模进行补料分批培养时，底物ATP供应不足、高浓度底物L-Met和产物SAM抑制成为SAM高产的瓶颈。本项目拟采用系统代谢工程研究思路，统筹考虑生物过程放大效应，针对SAM合成中的酶活、底物和产物，设计三组可控的基因和环境扰动，即利用GAP启动子文库调控MAT表达实现基因扰动影响ATP需求；通过反应器恒化培养实施L-Met和SAM浓度环境扰动。对ATP、L-Met和SAM单一或交互作用下细胞的转录谱进行差异分析，系统优化SAM合成，构建高产工业菌。本项目以毕赤酵母中ATP参与的SAM合成反应为模型，在全局代谢网络中解析ATP合成调控机制，对于在这一具有重要工业应用价值的细胞中开展代谢工程及合成生物学研究具有重要意义。

S-腺苷甲硫氨酸（SAM）是具有广阔市场前景的药物和保健品。本项目针对强化SAM合成酶（MAT）表达后，重组Pichia pastoris（毕赤酵母）在大规模培养过程中，高效积累产物时所遇到的底物ATP供应不足、高浓度底物L-Met和产物SAM抑制等问题，按照表型分析（以转录谱分析为核心）、靶标基因寻找、基因操作工具优化和代谢改造的循环，开展系统代谢工程研究。. 对重组菌实施可控的基因和环境扰动后，转录谱差异分析显示，MAT高表达使甲醇能量代谢、TCA循环以及氮源利用相关基因出现显著上调，添加L-Met也使甲醇能量代谢基因上调，但AMP合成、TCA循环以及氮源利用相关基因出现显著下调。这些结果暗示，缺乏ATP骨架、能量供应不足，以及L-Met底物分解可能是限制SAM高产的瓶颈。. 为了有效地进行代谢改造，从三方面对基因操作工具进行了优化。第一，建立高通量筛选方法，从组成型启动子GAP突变文库中，筛选获得了调控范围在原启动子强度0.6％－19.6倍之间的33个突变启动子，组成功能性GAP启动子文库，可实现基因表达的连续精确调控。第二，以来自于E.coli的MazF作为反向筛选标记，建立可用于P. pastoris的无选择标记基因操作方法。第三，获得了来自于Pichia stipitis（树干毕赤酵母）的氧限制启动子PsADH2，将其用于P. pastoris中，能自发响应溶氧动态变化，激活并调控基因表达。. 在此基础上，以强化MAT表达的第一代高产菌GS115/DS16为出发菌，构建了一系列第二代高产菌。其中，弱化了β-胱硫醚合成酶表达的重组菌G12-CBS， SAM产量比出发菌提高31%。经发酵过程优化后，G12-CBS在15 L罐中的最高产量达到出发菌的1.5倍（13g/L），具备了工业应用价值。. 本项目通过转录谱分析寻找代谢改造靶标基因，建立了高效的基因操作工具，通过代谢工程改造，获得了可用于工业生成的SAM高产菌。更为重要的是，这些方法和材料的积累，对于在毕赤酵母中进行深入的代谢工程和合成生物学研究，具有重要价值。.