猪瘟C株疫苗毒感染免疫特异的CD4+/CD8+ T细胞亚群αβTCR的分子结构特征及其免疫学功能

αβT cell receptor(αβTCR) take an important role in host acquired cellular immunity.But investigation of T cell cloning proliferation in porcine infected by viruses is still not report due to the diversity and complexity of αβTCR.This project firstly sorting and identify the CD4+/CD8+ T cell subgroup with flow cytometry,and amplify,clone and establish the repertoires of αβ TCR gene by AL-PCR according the phenomenon of T cell cloning proliferation through the generearrangement of TCR stimulating by infection of C strain-swine fever virus.Then analyze the genetic constitution,structural feature and its diversity and specifity of αβTCR by technique of bioinformation,and highlight the rule of T cell cloning proliferation in infection. Thirdly,construct these recommbinant expression vector of TCR expressing in animal cell using information of the α or β TCR of CD4+/CD8+ T cell respectively, and transgenic modify defined CD4+/CD8+ T cell of porcine.And,observe and analyze immunological effect of interaction between the T cells and APCs.

T细胞受体（αβTCR）在机体获得性细胞免疫中扮演着重要角色，但由于其基因的遗传多样性和结构复杂性，基于病毒感染或免疫特异的猪αβT细胞克隆化增殖研究在国际上尚属空白。项目针对猪瘟C株疫苗毒感染小型猪可激发其αβTCR胚系分化和基因重排而引起的T细胞克隆化增殖现象，采用流式细胞仪法分选和鉴定猪CD4+/CD8+ T细胞亚群，应用接头连接介导的通用PCR法高通量扩增、克隆和建立包含大量未知αβ链的TCR基因库；采用生物信息学技术分析αβTCR基因的分子结构特征及其多样性与特异性，探讨猪αβT细胞克隆化增殖规律；选择病毒感染免疫特异的CD4+/CD8+ T细胞的αβTCR分子，分别构建其荧光标记的动物细胞表达载体，转基因修饰特定CD4+/CD8+ T细胞后，研究其与靶细胞互作产生的免疫学效应，阐明其遗传多样性与免疫学功能特异性的分子基础，为猪瘟表位肽高效疫苗研究及其疫病控制提供理论依据。

猪瘟病毒C株疫苗在预防和控制猪瘟流行中发挥了关键作用，但其细胞免疫的保护性机制不明确。T细胞受体（αβTCR）在机体获得性细胞免疫中扮演着重要角色，但由于其基因的遗传多样性和结构复杂性，基于病毒感染或免疫特异的猪αβT细胞克隆化增殖研究在国际上尚属空白。项目针对猪瘟C株疫苗毒感染免疫猪可激发其αβTCR胚系分化和基因重排而引起的T细胞克隆化增殖现象，采用流式细胞仪法分选和鉴定猪CD4+/CD8+ T细胞亚群，应用通用PCR法高通量扩增、克隆和建立包含大量未知αβ链的TCR基因库；采用生物信息学技术分析αβTCR基因的分子结构特征及其多样性与特异性，探讨猪αβT细胞克隆化增殖规律；选择病毒感染免疫特异的CD4+/CD8+ T细胞的αβTCR分子，分别构建其荧光标记的基因修饰的CD4+/CD8+ T细胞后，研究其免疫学效应，阐明其遗传多样性与免疫学功能特异性的分子基础。现取得主要研究结果与结论如下：.1. 在国内首次开展了猪TCR分子基因结构与复杂性研究, 明确了猪TCRα和β链基因的基本结构与特征；2. 首次成功建立了猪CD8+、CD4+的T细胞亚群TCR CDR3区基因谱型分析技术，分析了健康合作猪TRA和TRB 的CDR3区的基因谱型种类及多样性，为猪TCRα链、TCRβ链基因复杂性研究提供了一个特别高效而方便的技术手段；3. 首次分析了猪瘟C株疫苗毒感染特异的T细胞αβTCR表达规律及其结构特征，明确了猪瘟C株疫苗免疫前猪CD4+和CD8+ T 细胞TCRα链和β链表达的规律及其结构特征，明确了免疫后猪CD4+和CD8+ T 细胞TCRα链和β链多样性与克隆化动态规律，明确了二次免疫后呈现克隆性扩增的TRAV和TRBV家族CDR3序列结构特征，为猪瘟病毒抗原肽疫苗研制和病原抗原免疫机制研究提供了依据。4. 首次克隆、鉴定了猪瘟病毒C株疫苗免疫/感染特异的T细胞全长TCRα链和β链基因，建立了表达猪TCRα链和β链蛋白的细胞模型，为其免疫学功能研究奠定了基础。5. 首次揭示了猪瘟C株疫苗免疫能诱导PBMC中SLA等位基因差异表达及优势选用现象，提示这可能与T细胞的克隆化发育分化存在一定的相关性。