活细胞DNA MMR活性分析新模型的构建及其在毒理研究中的应用

DNA错配修复(MMR)活性起着维持基因组稳定的作用，被认为是第三类肿瘤相关基因。一种基于绿色荧光蛋白(EGFP)表达来定量活细胞DNA MMR活性的分析模型于2004年被首次提出，但该模型因EGFP本底值过高等原因而无法推广应用。本项目拟在通过无义突变策略彻底消除该模型EGFP本底过高等前期基础上，采用双顺反子克隆技术为该模型再引入一个红色荧光蛋白(RFP)基因作为报告基因，构建一个全新的双荧光蛋白表达模型。新模型可使EGFP基因与RFP基因实现同步表达，因而可使分析的精确度、灵敏度、稳定性、可操作性等得到大幅提高。然后，用已知具MMR基因毒性的乙基亚硝基脲和其它化学污染物 (如Cd、PCBs和PFOS等)来验证与评估该模型在细胞毒理学研究中的适用性与优越性。其成果不仅可为环境污染物的致癌毒性、致突变毒性和遗传毒性提供一种全新的定量评价技术，还可在微观上发掘污染物生物毒性的分子机制。

DNA 错配修复(MMR)活性起着维持基因组稳定的作用，被认为是第三类肿瘤相关基因。本课题围绕DNA错配修复新模型的构建及其在毒理学中的应用，已成功构建了三对双色荧光质粒，并验证了其在活细胞DNAMMR功能活性分析中的实用性。验证了经过优化的基于绿色荧光蛋白活细胞DNA MMR功能活性分析模型在评价环境污染物对细胞DNA MMR功能毒性方面的实用性。实验结果表明，环境致癌物苯并芘（BaP）暴露人类乳腺癌细胞会抑制细胞DNA MMR活性，而全氟辛烷磺酸（PFOS）暴露对细胞DNA MMR活性无明显影响。建立了活体斑马鱼DNA MMR功能活性分析模型，并证实了其在评价环境污染物对斑马鱼胚胎DNA MMR功能毒性方面的实用性。实验结果显示，BaP和CdCl2长期慢性暴露斑马鱼对其子一代胚胎MMR活性有抑制作用，而PFOS暴露对斑马鱼子一代胚胎则无明显影响。建立了青鳉鱼DNA突变率检测技术并检测了环境污染物PFOS和BDE-47对DNA突变率的影响。此外，我们还利用模式动物斑马鱼开展了环境污染物三甲基氯化锡（TMT）、植物雌激素以及重金属等对斑马鱼胚胎发育毒性效应的研究。通过本项目的实施，我们已经申请了2项国家发明专利、 发表了6篇SCI收录论文并培养了9名硕士研究生。这些研究成果不仅可为环境污染物的致癌毒性、致突变毒性和遗传毒性提供一种全新的定量评价技术，还可在微观上发掘污染物生物毒性的分子机制。