新型降解因子-脱氢酶参与生物质解聚作用机理研究

The highly complex structure of lignocelluloses became the obstacles for lignocelluloses degradation. Our previous work has found a new synergistic factor designed as dehydrogenase with non-hydrolytic activity in the extracellular proteins of Penicillium piceum. The dehydrogenase involved in redox reaction accompanied by a large number of free radicals generated, while the network structure and the crystalline regions of the biomass destroyed, providing for the rapid degradation of the enzyme proteins. The mechanism of dehydrogenase involving in cellulose degradation was unknown and needed to be further studied. This project will focus on the new functions and mechanism of this synergetic factor on the basis of the characteristics and structure analysis. Fluorescence microscopy and scanning electron microscopy observed the whole depolymerization process by dehydrogenase fused with green fluorescent protein. The hydroxyl radicals generation process was analyzed by HPLC and electron spin resonance in the lignocelluloses depolymerization by dehydrogenase. The structure change of biomass before and after dehydrogenase was analyzed by FT-IR, XRD, 13C-NMR, to in-depth analyze the mechanism of dehydrogenase involving in cellulose degradation or depolymerization. The synergism between dehydrogenase and cellulase improved the performance of fungal cellulase, which could provide a new way for decreasing the cost of biomass utilization.

生物质结构的高度复杂性成为其难以被降解的主要原因。我们前期工作发现在桧状青霉胞外酶系中存在一种新型的非水解活性的，与纤维素酶协同作用的脱氢酶。该脱氢酶参与生物质氧化还原反应，并生成大量的自由基，参与破坏生物质的氢键网络结构和结晶区，使得生物质结晶结构无序化，为酶蛋白的快速降解提供条件，但其作用机理尚待深入研究。本项目在对脱氢酶独特性质与结构研究的基础上，利用分子生物学和荧光显微镜/扫描电镜观察荧光标记后的脱氢酶参与生物质前处理全过程；利用HPLC和电子自旋共振分析脱氢酶解聚生物质过程中参与的氧化还原反应以及羟基自由基产生过程；通过FTIR, XRD, 13C-NMR分析脱氢酶处理生物质前后结构的变化，进而深层次剖析其参与生物质降解或解聚作用的模式与相关机理。通过脱氢酶与不同纤维素酶的协同作用，分析真菌高效酶解体系中组分多样性，为提高生物质炼制效率，降低生产成本提供了一个新方法。

木质纤维素结构的高度复杂性和酶系组分的多样性成为研究纤维素降解机制的障碍。依托蛋白质组学数据, 在桧状青霉胞外酶系中纯化到一种新型的非水解活性的，与纤维素酶协同作用的降解因子。该降解因子通过MALDI-TOF鉴定为脱氢酶蛋白。当脱氢酶以40 μg 蛋白/g底物浓度分别向不同纤维素酶系中添加，里氏木霉酶液、桧状青霉酶液、NWX(诺维信公司提供)、KDN(康地恩公司提供)等纤维素酶系的水解效率分别提高了19.4% ，35.4%， 18.5%， 15.2%。脱氢酶没有检测到水解酶活力，但是当其单独处理不同的木质纤维素材料后，水解产物中都有少量的D-葡萄糖和D-山梨醇，并且检测到羟基自由基的产生。利用红外衍射、 X-射线衍射和固体核磁分析脱氢酶单独处理后的木质纤维素结构变化，发现木质纤维素结晶区和氢键结构都遭到破坏，结晶度和氢键强度明显降低。将脱氢酶与绿色荧光蛋白融合后单独作用于玉米秸秆，通过荧光显微镜观察玉米秸秆绿色荧光变化轨迹，解析脱氢酶参与木质纤维素解聚作用的路径。脱氢酶开始结合在玉米秸秆表面，然后层层渗透，结合在每层纤维素层面。脱氢酶在木质纤维素降解初期的24 h内就可以完全渗透进入木质纤维素内部。我们推测该脱氢酶不破坏木质纤维素β-1,4糖苷键，而是参与一系列氧化还原反应，并伴有羟基自由基生成。由于脱氢酶蛋白和羟基自由基分子量都较小，在木质纤维素降解的初期，便于渗透进入木质纤维素内部。羟基自由基具有强氧化性，当羟基自由基进入木质纤维素内部后，靠羟基结合的氢键结构消失，链间的作用力变小，使木质纤维素结晶区趋于无定形化，大大降低了木质纤维素抗降解的屏障，为纤维素酶酶解提供有利条件，所以脱氢酶与商业纤维素酶之间存在强烈的协同作用。该项目发现这种脱氢酶蛋白属于促生物质降解因子，充分体现真菌高效酶解体系中组分多样性。这种纤维素酶辅因子的发现一方面有利于剖析纤维素酶降解木质纤维素的作用机理，另一方面为提高纤维素酶水解效率，降低纤维素酶用量，降低纤维素酶成本提供了一个新方法。