基于酿酒酵母代谢工程改造降低黄酒中氨基甲酸乙酯含量的研究

Ethyl carbamate (EC) is a potential carcinogenic compound presented in Chinese rice wine, which is generated by the reaction between urea and ethanol. Since the urea derived from the arginine degradation by Saccharomyces cerevisiae is known as the main precursor of EC in Chinese rice wine, EC formation can be depressed by construction of engineered yeast strain with lower-generation of urea. However, the possibility of minimizing urea and EC contents by metabolic engineering is limited because the urea secretion mechanism of yeast is unknown. In the present study, the functional proteins and genes that involved in the secretion pathway of yeast is illuminated in order to clarify the urea secretion mechanism of yeast by the approach of transcriptomics and RT-PCR. Meanwhile, the engineered strain is constructed for urea and EC elimination by metabolic engineering of the urea pathways of generation, degradation, absorption and secretion in an industrial Chinese rice wine yeast strain. The safety of the Chinese rice wine will be improved by the application of the genetically modified yeast strain, which is beneficial to the development and inheriting of the Chinese rice wine.

氨基甲酸乙酯（简称EC）是存在于黄酒中的潜在致癌物，主要由发酵醪液中的尿素和乙醇反应生成。酿酒酵母在发酵过程中代谢精氨酸产生的尿素是黄酒中形成EC的主要前体物。因此，构建低产尿素的酵母工程菌，可以减少EC的形成。然而，目前酿酒酵母的尿素分泌机制尚不明确，也就限制了通过代谢工程改造最大程度地降低发酵液中尿素和EC含量的可能性。本研究拟通过转录组学和RT-PCR等分子生物学技术明确参与尿素分泌的关键酶及功能基因，阐明酿酒酵母在黄酒发酵过程中的尿素分泌机制。同时，在此基础上利用食品安全级代谢改造手段，对黄酒生产用酿酒酵母的尿素生成途径、降解途径、分泌途径和吸收途径同时进行改造，构建不向发酵醪液分泌尿素且能够高效降解尿素的工程菌，从而减少发酵液中尿素的含量以及黄酒中EC的形成。低产尿素和EC工程菌的应用有利于提高黄酒的饮用安全性，对于中国黄酒的传承和发展具有重要意义。

氨基甲酸乙酯（EC）是存在于黄酒中的潜在致癌物，主要是由尿素和乙醇自发反应生成的。黄酒发酵液中尿素含量的多少直接影响EC含量的高低，因此，降低发酵液中尿素的含量是减少黄酒中EC含量的首要途径。然而，酿酒酵母的尿素分泌机制尚不明确，也就限制了通过代谢工程改造最大程度地降低发酵液中尿素和EC含量的可能性。本研究利用转录组学等分子生物学技术和基因敲除的验证方法初步探索了酿酒酵母中参与尿素分泌的功能基因，明确了尿素胞内转运蛋白（Dur3p）不具有尿素分泌的功能。以前期构建的既高效表达脲基酰胺酶基因（DUR1,2），又敲除了精氨酸酶（CAR1）的酵母工程菌N85DUR1,2-car1为出发菌株，利用食品级代谢工程改造手段将其DUR3基因进行了高效表达，获得了酵母工程菌N85DUR1,2/DUR3-car1。黄酒发酵实验结果表明，工程菌发酵液中酒精度、总酸、总糖等常规理化指标与出发菌株基本一致，而过表达DUR3基因的酵母工程菌N85DUR1,2/DUR3-Δcar1发酵液中尿素和EC的含量分别为3.1 mg·L-1和16.5 μg·L -1，与亲本菌株N85和出发菌株N85DUR1,2-Δcar1相比，尿素含量分别降低了92.0%和43.7%，EC含量分别降低了58.5%和17.6%。而且经过8次连续传代发酵后，工程菌可稳定降低发酵液中42.6%的尿素含量。说明过表达DUR3基因的酵母工程菌可以在黄酒发酵过程中吸收醪液中的尿素，从而进一步降低发酵液中尿素的含量，减少了EC的形成，且不影响黄酒的品质。因此，低产尿素的黄酒酵母工程菌的构建，有利于提高我国黄酒饮用安全性，对中国黄酒的传承和发展具有重大意义。此外，本研究对酿酒酵母的瓜氨酸代谢途径进行了代谢工程改造，以探索通过减少黄酒中EC的另一重要前体物——瓜氨酸的含量，来减少发酵液中EC积累的可能性。通过敲除瓜氨酸合成基因ARG3以及高效表达瓜氨酸降解基因ARG1和ARG4，构建了工程菌N85ARG1,4-arg3。黄酒发酵实验表明，高效表达ARG1和ARG4基因可以促进酿酒酵母中瓜氨酸的降解，从而降低黄酒发酵液中瓜氨酸的含量，但是工程菌N85ARG1,4-arg3发酵液中EC的含量增加了28.5%，说明单纯通过代谢改造酿酒酵母的瓜氨酸代谢途径来降低黄酒发酵液中EC含量的效果不明显。