用于生长因子类药物生殖发育毒性评价的小鼠胚胎干细胞特异性分子标记物的筛选

胚胎干细胞（embryonic stem cell,ES细胞）是在体外具有无限自我更新能力的未分化细胞，其分化潜能可再现体内胚胎发育的全过程,且ES细胞对药物等的敏感性远高于其它已分化细胞，在检测外源物胚胎毒性或致畸性中有重要应用价值。但目前用ES细胞来检测生物药物生殖发育毒性的报道很少,且目前的胚胎干细胞试验(embryonic stem cell test,EST)多属于定性的细胞毒性和形态学研究。本课题欲建立小鼠EST模型，从细胞毒性、分化影响以及不同阶段组织特异性分子标记物（molecular markers）基因表达水平的研究，确定aFGF等生长因子类药物较大剂量使用时是否具有直接或潜在的胚胎毒性及致畸性，为生长因子类药物的安全性评价提供科学依据。并比较几种生长因子类药物的特点与共性，评价EST模型及所筛选的毒性相关组织特异性分子标记物预测该类药物体内生殖发育毒性的有效性。

胚胎干细胞（ESC）是在体外具有无限自我更新能力的未分化细胞，其分化潜能可再现体内胚胎发育的全过程，在检测药物等外来物胚胎毒性或致畸性中有重要应用价值。本课题欲建立小鼠胚胎干细胞试验（EST）模型，从细胞毒性、对细胞分化的影响以及对ES细胞不同阶段组织特异性分子标记物表达水平的研究，确定生长因子类药物（growth factors, GFs）较大剂量使用时是否具有直接或潜在的胚胎毒性。.试验结果：1. GFs胚胎毒性确定和分级：根据研究结果，判定aFGF、bFGF均具有弱胚胎毒性；EGF和NGF胚胎毒性与否正在研究中。.2. GFs对ES细胞自然分化不同阶段特异性分子标记物的影响：①aFGF在0.01-100μg/ml 剂量范围内，低剂量时促进三胚层组织特异性基因表达，大剂量则抑制内胚层特异性基因的表达。② bFGF在0.01-30μg/ml剂量范围内，低剂量促进三胚层组织特异性基因表达，高剂量抑制内胚层和中胚层特异性基因表达，而对外胚层特异性基因表达具有促进作用。.3. bFGF对ESC向神经细胞诱导分化的影响：在0.01-10μg/ml浓度范围，bFGF促进不同神经前体细胞特异性基因如Nestin和Pax-6和神经元细胞特异性基因如NF-M、Tuj-1和Map2的表达，而对神经胶质细胞基因GFAP的影响不明显；对神经组织特异性蛋白表达的影响与其对相应基因影响的趋势一致。当bFGF大于1μg/ml时直接抑制神经冠状结构的形成。.4. bFGF对ESC向心肌细胞诱导分化的影响：在0.01-10μg/ml浓度范围内，心肌细胞特异性基因BMP4、MLC-2v和Nkx2.5的表达量随bFGF浓度的加大呈下调趋势；心肌特异性蛋白表达量，除α-actinin和GATA4在bFGF浓度为0.01μg/ml时上调外，所有蛋白在的表达量均呈明显下调趋势。.结论：.用EST模型判定aFGF、bFGF具有弱胚胎毒性，其毒性机制可能与二者对ESC分化过程中不同组织特异性基因和蛋白表达的不平衡影响有关，其对内胚层特异性基因ALB、GATA6和TTR表达的抑制作用可能对评价GFs胚胎毒性具有一定的标记性意义。该研究对评价GFs的生殖发育毒性和研究、开发该类药物提供了参考，更重要的是为GFs的临床安全用药提供了科学依据。.