肠道病毒71型3D聚合酶及非编码区中神经毒力位点的精确定位及相互作用研究

EV71 is the main pathogens of HFMD and has been become the most important CNS toxicity pathogen in Infant.However, the mechanism of CNS infection by EV71 has not been elucidated.Our previous studies found thatthe proliferation rate or viral load showed significant differences between isolates from severe and light HSMD cases. We speculate that the difference of the virus proliferation may cause different viral loads in the hosts and different outcomes of the disease.The critical point mutations were found by sequence analysis of5'UTR, 3'UTR and 3D polymerase, which were critical regions for viral replication.These mutations may affect thereplication ability, thereby affecting virulence.In this project, micro-replication and crystal structure of 3D polymerase were used to study the function of candidate sites in 3D polymerase and untranslated regions. These mutations may affect the temperature sensitivity, replication andvirulenceof EV71.Combined with the crystal structure of 3D polymerase, relations between mutations and structure or function were analyzed, and effection to virulence and critical sites of 3D was determined.This study provides important data to reveal the relationship of EV71 replication and virulence.

EV71是手足口病的主要病原体，已取代脊灰成为最重要的婴幼儿CNS毒性病原。然而EV71导致CNS感染的机制尚未阐明。我们的前期研究发现，在体内和体外实验中，轻、重症毒株的增殖速度均有明显差异，病毒载量明显不同。我们推测可能是病毒增殖速度差异导致宿主体内病毒载量不同，从而导致毒力不同。序列分析在5′UTR、3′UTR和3D聚合酶发现了关键位点突变。这些区域对病毒复制很重要。这些突变可能影响了病毒的复制能力，进而影响了毒力。本研究拟在此基础上通过微复制子系统和蛋白晶体结构对3D聚合酶和非编码区的候选位点进行功能研究。利用微复制子研究突变对病毒的温度敏感性和复制的影响，确定其对病毒毒力的作用及各位点的相互作用；结合3D聚合酶的晶体结构研究，分析3D聚合酶突变位点与结构和功能的关系，明确3D聚合酶在病毒毒力中的作用，确定3D聚合酶的毒力位点。为揭示EV71的复制与病毒毒力的关系提供重要数据。

EV71是导致重症手足口病的最主要病原体，其致病机制尚未完全阐明。我们前期研究通过序列分析筛选了多个毒力候选位点，为研究这些位点的作用，本研究分别构建了肠道病毒71型3种微复制子，结果发现这些微复制子均能在细胞中进行蛋白表达（荧光蛋白表达检测到荧光），但检测不到RNA独立复制（实时荧光定量PCR检测基因拷贝数）。而同步进行的反向遗传学研究成功构建了EV71强毒株的感染性全长cDNA克隆，并成功拯救病毒，继而将5′UTR、3′UTR、VP1、2A、3B、3CD、3D分别置换为弱毒株的对应区域，拯救突变病毒；对突变病毒进行相应的复制力和致病力检测，探讨各置换区域涉及的突变位点在病毒毒力中的作用。结果表明，5′UTR、VP1、2A、3D置换后，病毒复制力和致病力有显著变化。为探讨其作用机制，检测了EV71强、弱毒株感染不同种类细胞后诱导细胞自噬的水平；并分别表达强、弱毒株的3D蛋白，进行蛋白质结晶，解析晶体结构，分析3D蛋白结构与功能的关系，试从结构角度进一步验证3D蛋白的关键位点在病毒复制中的作用。强、弱毒株的3D蛋白均顺利表达和纯化，并获得蛋白质晶体，晶体结构初步解析，目前已进一步优化了晶体，以便采集更为理想的数据。在自噬水平检测方面，研究结果显示，EV71的强毒株可在神经细胞SH-SY5Y诱导自噬，突变VP1上关键位点后，细胞自噬水平明显下降，且CPE严重减弱，病毒复制曲线也呈明显下降趋势。该结果表明，VP1与细胞自噬水平有关，且自噬水平与病毒复制力也密切相关。在此基础上，下一步的研究计划将包括两个方面：对置换过程中引入的突变位点在毒力中的作用进行逐一精确定位；探讨VP1对自噬通路关键信号分子的影响，筛选出与其相互作用的自噬关键因子，阐述VP1影响宿主细胞自噬的分子机制，研究自噬对病毒复制力和毒力的影响及机制，尤其是对神经毒力的影响，为阐述病毒的致病机制提供重要数据。