大肠杆菌麦芽糖结合蛋白与卡介苗协同促进Th1细胞活化机制及其抑制肿瘤生长作用研究

大肠杆菌麦芽糖结合蛋白（MBP）是分子生物学常用的标签蛋白，人们普遍认为其无生物学活性，我们最近首次发现MBP能诱导Th1活化，并且与BCG协同促进Th1活化，抑制不同肿瘤生长，但机制尚不清楚。本研究拟在前期工作基础上，采用流式细胞仪分选正常小鼠和免疫小鼠（MBP、BCG及MBP+BCG）的CD4+T细胞，在MBP刺激与非刺激条件下，分析静息或活化的CD4+T细胞的增殖、存活、Th1亚群和MBP作用定位及靶分子，深入探讨MBP与BCG协同刺激Th1活化的分子机制，阐明MBP对多克隆Th1的直接刺激增殖活化作用以及与BCG的协同促进作用。通过小鼠肿瘤模型分析MBP与BCG协同抗肿瘤机制，阐明Th1活化在肿瘤生长抑制中的作用，进一步揭示Th1在抗肿瘤中的重要地位。最终揭示其作为治疗性疫苗佐剂的应用价值和广谱抗肿瘤生物药的开发价值和临床应用前景。

1、 MBP联合BCG通过TLR2/TLR4/TLR9 cross-talk直接诱导Th1.本研究以TLRs为切入点，以MyD88依赖途径与TRIF依赖途径为主线，深入探讨MBP联合BCG协同诱导Th1活化的作用机制。通过免疫磁珠纯化小鼠CD4+ T细胞，采用CD3和CD28抗体使之活化，检测MBP和BCG对活化的CD4+ T细胞TLRs通路相关信号分子的影响；并进一步利用TLR2、TLR4抗体和TLR9抑制剂研究TLR及其介导的信号传导分子在Th1活化中的作用。 结果显示MBP联合BCG后，通过显著上调TLR2/TLR9介导的MyD88/TRAF6表达，下调TLR4介导的TRIF/TRAF3表达引起高水平的Th1活化。提示在TLR信号通路中TRAF6上调可促进Th1活化，TRAF3上调则引起相反的作用。此外，我们分别用TLR2/TLR4抗体、TLR9抑制剂和TLR2/TLR4/TLR9激动剂预处理CD4+ T细胞，qRT-PCR实验检测TLR2/TLR4/TLR9的mRNA水平。结果提示在MBP联合BCG诱导的Th1活化中，TLR4可抑制TLR2介导的信号传导；TLR9可促进TLR2和TLR4介导的信号传导，说明三者之间存在crosstalk，并且TLR9在其中发挥关键作用。.2、MBP联合BCG通过TLR2/TLR4诱导DC促进Th1活化.本研究采用TLR2、TLR4基因敲除小鼠，通过体内、体外实验研究结果显示，TLR2、TLR4表达对MBP联合BCG体内免疫小鼠DC细胞共刺激分子表达、促进Th1活化具有重要作用，MBP联合BCG通过TLR2和TLR4诱导DC细胞活化和成熟间接促进Th1增殖与活化。.3、本研究采用小鼠Lewis肺癌模型和小鼠黑色素瘤模型进行研究，结果显示单独BCG或单独MBP对肿瘤的抑制作用不明显，但当MBP联合BCG后，表现出明显的抗肿瘤作用。结合本研究组对二者联合作用的机制探讨发现，MBP和BCG单独尽管也能诱导Th1活化，但联合后Th1活化作用更明显，与抗肿瘤的作用结果呈现一致性，也提示MBP联合BCG免疫后的抗肿瘤作用，与二者协同增强Th1细胞活化有关。