脑型肌酸激酶对NF-κB信号通路的调控作用研究

Creatine kinase plays a key role in the energy homeostasis of vertebrate cells, and is involved in the pathological processes of many diseases. Based on previous work of the applicant that revealed how brain creatine kinase (CKB) affects metabolism of ovarian cancer cells, this project is aimed to investigate the influences of CKB on ovarian cancer cell metastasis. Combining the research of bioinformatics and preliminary results, we found that CKB probably affects ovarian cancer cell metastasis by regulating NF-κB pathway. In this project, we are aimed to investigate the influences of CKB on NF-κB activity, reveal how CKB regulates the expression of NF-κB subunit p65, elucidate the mechanism that how CKB affects ubiquitination and degradation of p65. We are also aimed to study the interaction of CKB and p65, find critical domains of the interaction, and analyze functions of the interaction in the modulation of NF-κB. These research will be helpful to explain the functions of CKB in regulating ovarian cancer metastasis. This project will for the first time reveal functions of CKB in regulating NF-κB, which is an important signaling pathway in the cell. The research will expand our understanding of the intracellular network of CKB and the functions of CKB in cancer progression.

肌酸激酶在调节脊椎动物细胞内能量稳态方面发挥着重要作用，也参与多种疾病的病理过程。本课题拟在此前的研究工作揭示脑型肌酸激酶（CKB）影响卵巢癌细胞的代谢状态后，进一步研究CKB对于卵巢癌转移等特性的影响。结合生物信息学研究和已取得的工作基础，我们发现CKB很可能通过调控NF-κB信号通路进而影响卵巢癌细胞的转移。在本课题中我们拟研究CKB对NF-κB信号通路活性的影响；揭示CKB调控NF-κB亚基p65表达的原因，阐明CKB影响p65泛素化降解的机理；研究CKB与p65的相互作用，找到相互作用的关键结构域，并分析这一相互作用在CKB调控NF-κB中的作用。通过这些研究解释CKB在调控卵巢癌细胞转移中的功能。这一研究将首次揭示CKB这一经典的能量代谢相关酶对NF-κB这一重要细胞信号通路的调控作用。研究结果将拓展我们对CKB在细胞内作用网络的认识，丰富我们对CKB在癌症进展中功能的理解。

肌酸激酶是动物细胞内参与能量运转、肌肉收缩、ATP再生的重要激酶。脑型肌酸激酶（Creatine Kinase Brain-type，CKB）在乳腺癌、卵巢癌、大肠癌及结肠癌等多种癌症中的表达呈现上调趋势，前期研究发现敲低CKB可以抑制卵巢癌细胞的生长代谢状态。NF-κB信号通路可以参与一系列与炎症发生、免疫应答相关基因的调控，该通路中的核心蛋白NF-κB主要以p65/p50二聚体的形式存在，作为转录因子在癌症的发生、发展中起着重要的作用。生物信息学预测CKB很有可能参与NF-κB信号通路的调控。本课题拟在此前的研究基础上，探究CKB对卵巢癌转移的影响，揭示CKB对细胞信号通路NF-κB的调控作用。主要研究结果如下：.（1）CKB调控NF-κB信号通路的活性。以卵巢癌SKOV3细胞株为材料，通过RNA干涉技术转染siRNA敲低CKB的表达，发现多个与癌症转移相关基因的表达产物发生了显著的下调，这些基因大多数是NF-κB信号通路的下游基因，特别是NF-κB信号通路核心蛋白p65的水平也发生下调，而通过转染质粒过表达CKB后，则p65蛋白的水平呈现上调的趋势。SKOV3细胞中具有活性的磷酸化的p65和IκB的变化与CKB的变化一致，这表明改变CKB蛋白的表达会调控NF-κB信号通路的活性。.（2）CKB通过影响p65蛋白泛素化水平调控NF-κB信号通路的活性。qRT-PCR结果显示，SKOV3细胞中上调或下调CKB蛋白的表达对p65蛋白的转录没有明显影响；而下调CKB蛋白的表达同时抑制新生蛋白质的合成，p65蛋白的半衰期缩短，上调CKB蛋白的表达则反之。Western blot结果证明，下调CKB蛋白表达增加了p65蛋白的泛素化的修饰程度，这说明敲低CKB可改变p65蛋白泛素化修饰加快其降解，从而降低NF-κB信号通路的活性。.（3）CKB与p65蛋白的RHD结构域相互作用影响p65泛素化。免疫共沉淀实验表明，CKB蛋白和p65蛋白在SKOV3细胞中互作；利用带His标签的p65蛋白进行镍柱亲和结合实验，结果表明CKB能够与p65蛋白专一结合。进一步将p65的两个结构域RHD和CTD分别构建在质粒上转染SKOV3细胞，免疫共沉淀结果表明，只有RHD结构域可以与CKB结合，此结构域也是E3泛素连接酶（ING4或PPARγ）与p65的结合部位，在SKOV3细胞中上调CKB蛋