cdx2基因在调控牛早期胚胎发育及在维持胚胎干细胞多能性中的作用

Embryonic Stem Cells (ESCs) research is most important for clinical medicine, regeneration medicine and gene modified animal research since it is competent to differentiate into all kinds of cells in our body. Up to now, only mouse, rat ESC lines were established and full ESCs animals were produced in this species. The claimed ESCs of farm animals, like cattle, sheep, pig have not been proved with such capacity. Even worse, bESCs could not be in vitro cultured with pluripotency for long term. In our previous study, we found the bovine embryonic stem like cells (bESLCs) from inner cell mass in long term culture gradually differentiated into trophoblast like cells, and trophoblast cells, which were also observed during transducing bovine inducd pluripotent stem cells. Cdx2 is a trphectoderm gene for specification and maintenance of the trophoblast lineage during mouse embryonic deveploment. It is still unclear how cdx2 regulates bovine embryo development in vivo and bESCs pluripotency in vitro.Our immunostaining analysis indicated that, cdx2 co-expressed in bovine embryonic inner cell mass (ICM) and trophoblast, even in cultured bESLCs. We speculated that cdx2 expression in ICM could induce bESLCs differentiate into trophoblast like cells.In this proposal, cdx2 expression in bovine embryos will be manipulated with either for over-expression or for knockdown. Mechanisms of cdx2 in regulating bovine embryonic development, in co-ordinating with other trophoblast and pluripotent genes and keeping bESCs pluripotency in vitro will be investigated. Our study will provide some basal findings for understanding bESCs pluripotency, which is significantly important for establishing bESC used for bovine animal clone.

胚胎干细胞研究因在转基因研究中的推动作用而受到广泛关注。然而目前，仅在小鼠、大鼠中建立了真正的胚胎干细胞。多年来，人们一直致力于牛胚胎干细胞研究，但却进展缓慢。已有报道中的牛类胚胎干细胞大多不能在体外稳定增殖、易分化，不具备真正的多能性。我们的研究中，长期培养内细胞团来源的牛类胚胎干细胞，存在着明显向滋胚层分化的趋势。类似的结果也存在于牛诱导多能干细胞的研究中。因此，我们推测牛内细胞团表达的滋胚层细胞关键基因，cdx2，可能诱导了干细胞向滋胚层的分化。目前，该基因在调控牛胚胎早期发育以及胚胎干细胞多能性方面的作用还不清楚。本研究通过改变胚胎中cdx2的表达水平，研究其在牛早期胚胎发育和与其他滋养层和干细胞多能性基因的相互作用，并研究cdx2对于牛胚胎干细胞分离、培养和体外多能性维持的影响。本项目的实施有助于深入了解牛胚胎干细胞多能性维持的分子机理，为真正建立牛多能性干细胞系提供理论支持。

牛胚胎干细胞的体外长期培养至今仍未获得成功。CDX2作为滋养外胚层特异调控因子，在牛囊胚内细胞团中依然表达。因此，该基因可能成为影响牛胚胎干细胞多能性体外长期维持的原因之一。本研究通过沉默CDX2在牛早期胚胎发育中的表达，探讨其对于牛早期胚胎发育和胚胎干细胞多能性的影响。结果显示，敲减cdx2没有显著影响牛囊胚发育，囊胚细胞数与对照组没有显著差异。CDX2敲减胚胎中OCT4、SOX2和NANOG多能性基因的表达和定位没有明显变化，但IFN-T、GATA3的表达显著下调，TEAD4基因表达显著上调。利用敲减胚胎进行牛胚胎干细胞的分离显示，CDX2基因敲减的牛胚胎干细胞能够长期维持单层克隆样生长，形态类似于人胚胎干细胞，并且长期维持OCT4、NANOG和SOX2基因的高水平表达及其启动子的低甲基化。该胚胎干细胞能够在体内外分化形成具有三胚层结构的类胚体和畸胎瘤。然而，对照组牛胚胎干细胞仅能在体外短期传代，且逐渐分化形成具有囊泡样结构的类滋养层细胞。虽然具有类胚体形成能力，但是该类胚体具有明显的滋养层特性，且不能形成畸胎瘤。该研究成果给牛胚胎干细胞体外长期培养和多能性维持提供了重要的理论支持，即降低CDX2的表达有利于牛胚胎干细胞体外多能性的长期维持，它为今后有针对性地优化牛胚胎干细胞体外培养体系提供了技术基础。. 此外，我们还对在敲减CDX2后显著诱导表达的TEAD4基因进行了初步的研究。TEAD4作为CDX2上游调控因子，是启动胚胎滋养层发育的关键基因。检测发现，在牛胚胎发育过程中，它在8-细胞期开始表达，在囊胚内细胞团和滋养层细胞中均定位于细胞核内。通过构建TEAD4敲减载体，并在牛肌肉卫星细胞中验证了敲减效率，且发现TEAD4基因的表达沉默显著影响该细胞向肌管和脂肪分化的能力。将继续深入探讨TRAD4和CDX2基因在牛早期胚胎发育中的分子调控机理，将有助于我们理解这些基因在调控牛内细胞团发育和干细胞多能性中的作用，进一步推进牛胚胎干细胞多能性的研究。. 以小鼠为模型，我们探讨了一个Wnt3a分泌永生细胞系，L-Wnt3a细胞对培养小鼠胚胎干细胞的影响，并发现利用该细胞制备的条件培养液，可显著维持无饲养层培养时干细胞的多能性，并且显著提升小鼠iPS细胞的诱导效率。