基于抑制消减杂交和比较蛋白质组学技术发掘阪崎肠杆菌毒力相关因子的研究

Enterobacter sakazakii is an important food-borne pathgoen and powdered milk has been implicated as the main transmission vehicle of E. sakazakii,which has been threatening the safety of dairy .It was reported that there existed virulence difference between Enterobacter sakazakii strains,but until now little is known about virulence-associated factors of E.sakazakii. By carring out the animal experiment combined with analysis and development of diseased issues slices to determine virulence difference of Enterobacter sakazakii strains, the subject will mainly carry out two contents:（1）The virulence-associated genes of high virulence and low virulence strains were enriched and cDNA subtractive library were contructed using suppression subtractive hybridization (SSH)techniques.The positive clones in cDNA library were selective and distribution of the positive colonies was detected in genomic DNA of high virulence and low virulence strains. The virulence-associated genes will be identified combined with analysis of software;(2)The protemic expression profiles of high virulence and low virulence E. sakazakii strains were contructed using two-dimensional gel electrophoresis(2-DE). The disctint protein spots in protemics prifiles of high virulence and low virulence strains were selected and further identified by mass spectrometry(MALDI TOF/TOF/MS) combined with analysis using related software and data bank. The expected results of the subject will reveal the virulence-associated genes and proteins from mRNA and protemics level and lay a good fundation for elusadating the causative mechnism of E. sakazakii, simultaneously providing mulecular targets for safety detection of E. sakazakii in dairy.

阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)是以奶粉为主要传播媒介的重要食源性致病菌，严重威胁到乳品的安全性，研究表明菌株间的毒力存在差异，但该菌的致病机制尚不清楚。本项目拟通过动物毒理实验，结合病理组织切片制作与分析，在确定菌株毒力差异基础上，主要开展两方面工作：（1）运用抑制消减杂交技术（SSH）富集强、弱毒株差异表达基因，构建cDNA消减文库，检测阳性克隆子在强、弱毒株基因组中的分布，结合软件数据库分析，鉴定毒力相关基因；（2）采用蛋白质双向电泳技术（2-DE）分别构建强、弱毒株全细胞和膜蛋白质图谱，开展图谱中特征差异蛋白质的筛选与分析，结合质谱技术(MALDI TOF/TOF/MS)与软件数据库分析,鉴定毒力相关蛋白质分子。项目预期结果将从mRNA与蛋白质组水平揭示毒力相关基因和蛋白质，为阐明其致病机制奠定良好基础，同时为乳品中阪崎肠杆菌安全性检测提供重要的分子靶点。

阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii），又名克罗诺杆菌（Cronobacter），包含有7个种，其中阪崎克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii）是在食品中分离频率最高兼具感染能力的三个菌种之一。本项目在对速冻食品和食用菌两类食品中的克罗诺杆菌进行污染调查的基础上，分离和鉴定克罗诺杆菌31株，并开展菌株抗生素敏感试验、抗渗透压及抗干燥能力的测定。基于目前克罗诺杆菌感染过程中相关的毒力因子仍尚不明确，本研究在分离菌株中开展动物病理实验研究，发现克罗诺杆菌菌株间毒力存在较大差异，分别选取毒力强弱菌株各一株（鉴定为阪崎克罗诺杆菌）开展乳鼠灌胃实验及病理组织切片分析。随后采用蛋白质双向电泳技术（2-D）开展毒力差异菌株的全菌蛋白质和膜蛋白质图谱的构建，并结合质谱技术和蛋白质数据库鉴定毒力差异菌株差异表达蛋白质，发现一些多种参与阪崎克罗诺杆菌毒力相关的潜在蛋白质，为阐明阪崎克罗诺杆菌致病机理奠定基础。在蛋白质组学的基础上，为了更全面发掘阪崎克罗诺杆菌的毒力相关基因，进一步开展阪崎克罗诺杆菌毒力差异菌株的比较转录组学研究，在mRNA水平上发现一系列毒力相关因子。本项目为阐明阪崎克罗诺杆菌致病的分子机制奠定了良好的基础数据，对预防和控制该菌污染导致的微生物安全具有重要的理论意义。同时，阪崎克罗诺杆菌形成生物膜能力很强，增加了食品加工过程中被持续污染的风险，本项目进一步开展分离菌株的生物膜形成能力差异分析及其氨基酸对生物膜形成的抑制作用研究，并在基础上运用蛋白质组学技术开展阪崎克罗诺杆菌生物膜态和浮游态细菌蛋白质图谱研究，发掘出阪崎克罗诺杆菌生物膜形成相关因子，为该菌污染危害形成的预防与控制提供重要的基础数据。