阪崎肠杆菌生物膜蛋白组学及与宿主作用机制的研究

阪崎肠杆菌是奶制品中的重要致病微生物，该菌在奶粉生产、加工中的存活与其生物膜结构形成密切相关，生物膜结构有助于细菌侵染并抵抗杀菌剂及免疫防御。本课题将建立阪崎肠杆菌生物膜模型，观察细菌在生物膜状态下生理生化特点，同时，进一步寻找阪崎肠杆菌感染宿主细胞中的特定表面分子，阐释细菌与宿主细胞间的主要作用机制。主要研究内容包括建立阪崎肠杆菌生物膜模型及阪崎肠杆菌对哺乳动物细胞粘附能力测试模型，利用双向电泳技术和EttanDIGE荧光蛋白差异技术比较生物膜细菌和浮游细菌蛋白组成的区别，利用特定抗体阻断作用寻找阪崎肠杆菌感染宿主细胞时的细菌表面粘附素蛋白（adhesin）及其所识别的宿主表面特异性受体（receptor）。上述研究有助于从奶粉生产、运输各环节对阪崎肠杆菌污染进行防控，为降低婴幼儿及免疫力低下人群阪崎肠杆菌感染的发生及死亡率提供理论和技术上的支持和保障。

背景：克诺罗杆菌（Cronobacter sakazakii，CS），原名为阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii, ES)，是奶制品中的重要致病微生物。主要引起早产儿及婴幼儿等免疫力低下人群的感染，可导致40-80%的高致死率。2008年，Iversen等建议将阪崎肠杆菌重新分类命名，成为肠杆菌科1个新属，即克罗诺杆菌属。到目前为止，克诺罗杆菌属包括10个种及3个亚种。研究方向：克诺罗杆菌在奶粉生产、加工等干燥高温条件下的存活与其生物膜结构形成密切相关，生物膜结构有助于克诺罗杆菌抵抗杀菌剂、恶劣环境，以及防御机体免疫机制，侵染宿主细胞等。本项目的研究方向主要针对生物膜形成的蛋白组学进行研究。研究内容：本课题选择了8株克诺罗杆菌不同种属或亚种的模式代表菌株，建立了克诺罗杆菌生物膜形成模型，采用结晶紫染色及荧光显微镜观察技术，比较了温度、培养时间及不同成分培养基对克诺罗杆菌形成生物膜能力的影响，以及不同菌株形成生物膜能力的差异。在此基础上，选取生物膜形成能力差异较大的两株菌株，利用同位素标记相对和绝对定量技术（iTraq技术）比较两株细菌蛋白质表达的差异，以及生物膜细菌和浮游细菌之间蛋白质表达的差异，并进一步采用荧光定量PCR对筛选获得的差异表达蛋白质进行RNA水平表达量验证。重要结果及关键数据：在生物膜形成能力有差异的两个菌株中，共发现1190个差异表达的蛋白质，与信号传导，细胞粘附，细菌结构等密切相关。其中448个蛋白表达差异在2倍以上，177个蛋白表达差异在5倍以上，其中包括81个表达上调的蛋白和96个表达下调的蛋白。进一步选择的20个蛋白基因作为靶标，建立荧光定量PCR方法从RNA水平检测其表达量变化，验证结果表明，RNA水平表达差异与蛋白水平表达差异基本一致。科学意义：本项目建立的克诺罗杆菌生物膜模型及生物膜相关蛋白组学数据库，对于研究克诺罗杆菌生物膜形成机制有关键作用，有助于阐释克诺罗杆菌在干燥、高压等恶劣环境下生存的机理，以及克诺罗杆菌侵染宿主细胞的机制。同时，生物膜形成的研究有助于从奶粉生产、运输各环节对克诺罗杆菌污染进行防控，为降低婴幼儿及免疫力低下人群克诺罗杆菌感染的发生及死亡率提供理论和技术上的支持和保障。