靶向神经血管单元研究钩藤散防治血管性痴呆的物质基础和基于转运体的配伍机制

Neurovascular unit is becoming the core of neuroprotection. The neuroprotection means recently not only protection for neurons but also protections for astrocytes and endothelial cells. Neurovascular unit consists of the neurons, astrocytes, endothelial cells and cell matrix even the interation and signal transduciton among them. It has been reported that Gouteng San (GTS), a traditional Chinese herbal formula, was safe and beneficial in treating vascular dementia (VaD)clinically and experimentally, but there is little report on active components and capatibility mechanism research. This proposal will search the active components of GTS based on the differrent cell lines of NVU, combined with blood-brain barrier in vitro, drug distribution studies in rat brain, and LC-MS/MS analysis of active compounds. The transportation and interaction of active components will also be clarified using MDCKII-MDR1 cells.The result of this proposal may offer a new strategy for the clarification of active material basis of herbal formula which is effective to the brain desease caused by multiple causes.

血管性痴呆(VaD)系脑血管病变引发的痴呆综合症，单纯的神经元保护难以实现VaD的治疗。神经血管单元(NVU)是由神经元、胶质细胞、微血管内皮细胞及细胞外基质等构成的脑功能单位，靶向NVU保护是神经保护剂的发展趋势。临床和实验研究显示中药复方钩藤散治疗VaD有较好疗效。本项目采用自上而下的复方活性物质组学研究模式，构建NVU体外高通量筛选模型，研究钩藤散神经保护的化学物质群；采用体外血脑屏障模型和动物在体脑组织分布研究进一步追踪其脑靶向作用的活性成分组，并结合现代分析技术进行它们的快速定性定量化学表征；在此基础上，采用稳定过度表达转运蛋白的细胞系研究活性成分组的脑转运机制和相互作用。本项目围绕全脑保护的活性成分组筛选、多层次化学表征和入脑机制的阐明展开研究，从新的视角和分子水平阐明钩藤散治疗VaD的物质基础和基于脑部转运体的协同作用，为复方配伍的基础研究和多病因脑源性疾病的治疗提供新策略

钩藤散（CTS）是中医临床痴呆症治疗的重要方剂，本项目靶向神经血管单元对其药效物质及神经保护作用机制进行多方面研究。我们对钩藤散全方进行了系统分离，采用多种体外模型进行神经保护的药效物质筛选与化学成分表征。结果钩藤散乙酸乙酯部位（CTS-E）具较强的神经保护活性；CTS-E可显著减少活性氧的产生，其神经保护作用与其抗氧化作用相关。采用现代分析技术建立了有效部位的定性定量表征方法并对方法学进行了验证。钩藤散40部位（CTS40）对H2O2诱导的氧化损伤具有显著的神经保护作用，可有效清除ABTS自由基，降低脂质氧化产物MDA的生成，并且抑制细胞内ROS水平稳定MMP，从而阻断促凋亡蛋白caspase-3和Bax的表达，促进抗凋亡蛋白Bcl-2表达发挥神经保护作用。采用正常健康转基因斑马鱼及内皮细胞生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（VRI）诱导血管受损转基因斑马鱼模型，对钩藤散单体进行血管新生活性研究，为神经保护作用机制探索新途径。采用小鼠记忆损伤模型研究钩藤散对模型动物学习和记忆功能的改善作用，以及脑内神经炎症和凋亡反应的影响。结果显示钩藤散可显著恢复小鼠的记忆损伤，同时降低海马内TLR-4 和NF-κB p65表达，并伴随促炎细胞因子TNF-α和IL-1β释放减少。在双侧劲动脉结扎认知损伤的大鼠模型上，钩藤散通过上调Nrf2/HO-1抗氧化应激通路改善慢性灌注不足诱导的大鼠认知障碍。采用HPLC-Q-TOF-MS技术，测定了钩藤散八种可以进入脑内的成分，并研究了钩藤-甘草在体内的相互作用，构建了ECV304/C6 共培养血脑屏障药物筛选模型。结果显示钩藤散复方配伍可增加君药钩藤的有效成分吸收，复方整体间呈现协同作用，结合正交实验设计法优化了钩藤散配伍组方，为其深度研发提供了基础和依据。