球毛壳菌免疫诱导蛋白EplW7的功能模体研究

Chaetomium globosum was used as biocontrol agent widely for plant pathogens. Current researches mainly focus on the interactions between C. globosum and pathogens. However, the interactions between C. globosum and plants are not well studied. Our previous studies have shown that C. globosum W7 could induce the resistance of soybeans to pathogens, that EplW7 protein plays a main role in the progress. Our recent studies have further shown that EplW7 was expressed in both its monomers and inactive dimers. The mechanism involved in systemic resistance triggered by EplW7 is still unknown. The eliciting activity of EplW7 is reduced greatly by homodimers. In this subject, based on the previous research, the eliciting motifs in EplW7 will be determined by serial deletions in EplW7 gene. Furthermore, the function of the eliciting motifs will be analyzed both in vitro and in vivo environments. The key sites for homodimer formation of EplW7 will be determined and mutated by truncated genes. Furthermore, high eliciting activity C. globosum strains will be constructed. This project will provide a new molecular target for underlying of the mechanism of EplW7, thus will provide further scientific theory for C. globosum-plant interactions.

球毛壳菌（Chaetomium globosum）具有良好的植物病害防治效果，目前研究主要集中在球毛壳菌与病原菌之间的相互作用，而对其与植物的相互作用研究较少。申请人前期研究证实，球毛壳菌W7可诱导大豆的抗病性，且其分泌蛋白EplW7起主要作用。本项目组进一步研究发现，EplW7以活性单体和无诱导活性的自身二聚体形式表达。目前，EplW7诱导植物抗病性的作用机制尚未研究清楚；并且二聚体的形成极大降低了EplW7蛋白的诱导活性。在此基础上，本项目拟（1）通过对保守序列的截短体构建，筛选EplW7蛋白的诱导活性模体（motif），并在体外和体内环境对模体的功能进行研究；（2）通过构建截短体，突变影响同源二聚体形成的关键序列，进而构建高诱导活性的球毛壳菌菌株。本项目为EplW7诱导活性机制提供了重要分子靶点，为揭示球毛壳菌-植物互作机制提供理论依据。

球毛壳菌（Chaetomium globosum）能够通过多种机制抑制植物病原菌，前期研究结果发现，它能够诱导大豆的抗病性，且其分泌的蛋白EplW7起主要作用。而EplW7诱导植物抗病性的作用机制尚未研究清楚，且同时以活性单体和无诱导活性的同源二聚体形式表达。本项目针对以上问题，对EplW7蛋白进行了密码子优化，并成功在大肠杆菌中进行了表达和纯化。在蛋白的纯化过程中，我们发现了EplW7蛋白在体外环境下会进行单倍体和二聚体之间的动态转化。这种互转现象意味着如果仅纯化单倍体或二倍体，并进行后续功能研究是无法区分二者功能的。通过一系列截短体构建，最终获得了影响同源二聚体形成的32-36位的关键序列，成功构建了EplW7△D，使其单倍体获得了高效表达。纯化的EplW7△D能够诱导大豆叶片的病原相关蛋白基因的表达上调，诱导叶片产生酚类物质等防御反应，减轻大豆灰斑病菌对叶片的损伤，说明突变的单倍体蛋白仍保留其诱导活性。通过对一系列截短体的比较分析，我们推定二聚体的形成不依赖糖基化、二硫键以及氨基酸的氧化交联，而是依赖于强疏水作用。同时我们筛选得到了EplW7蛋白的诱导活性关键模体（motif），位于蛋白表面的2个环状多肽，为EplW7诱导活性机制提供了重要分子靶点。我们首次发现EplW7蛋白具有类膨胀素活性，并且能够与纤维素酶对多种木质纤维素进行协同降解。该结果表明毛壳菌的EplW7蛋白能够软化植物细胞壁，协助随菌丝进入胞壁后并诱导植物的抗病性。课题的完成为揭示球毛壳菌-植物互作机制提供分子靶点并扩展了理论依据。