MST1对诱导性多能干细胞分化成类β-细胞的作用及机制研究

β-like cells transplantation is a good treatment for diabetes. The β-like cells were induced from stem cells in vitro facing the problem of insufficient insulin secretion, low sensitivity to the change of glucose concentration and so on，so it is difficult in clinical application. Pancreatic duodenal homeobox-1(PDX1) regulates a series of genes associated with the function of β-cells, and then affects the secretion of insulin. Mammalian sterile 20–like kinase-1(MST1) is an important regulatory factor in the process of cell apoptosis, which can directly regulate PDX1, enhance the transcriptional activity, and inhibit the apoptosis of pancreatic cells. However, the role of MST1 have not been reported in the process of induced pluripotent stem cells differentiating into the β-like cells. In this project, we will study the role and mechanism of MST1 on the differentiation of induced pluripotent stem cells into β-like cells by immunohistochemistry, fluorescence quantitative PCR, ELISA, shRNA and so on, explore the factors affecting the maturation of β-like cells, and optimize the induction and differentiation system. It has an important guiding significance for obtaining β-like cells with the function of insulin secretion in vitro.

类β-细胞移植是一个很好的治疗糖尿病的方法。干细胞体外诱导分化的类β-细胞因胰岛素分泌量少及对葡萄糖浓度变化不敏感等问题而难以在临床推广应用。胰腺十二指肠同源框蛋白1（pancreatic duodenal homeobox-1, PDX1）调节一系列与β-细胞功能相关的基因，影响胰岛素分泌。丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶（mammalian sterile 20–like kinase-1，MST1）是一个重要的调节细胞凋亡的因子，可直接调控PDX1转录活性，抑制胰腺细胞凋亡。然而，MST1对诱导性多能干细胞分化成类β-细胞的作用至今还未见报道。本项目利用免疫组织化学、荧光定量PCR、ELISA、shRNA等技术研究MST1在诱导性多能干细胞分化成类β-细胞过程中的作用机制，探讨类β-细胞体外成熟的条件，优化其诱导分化体系，对于体外获得正常的具有胰岛素分泌功能的β-细胞具有重要指导意义。

本研究在干细胞向β-细胞诱导分化的过程中，使用重组MST1沉默慢病毒载体进行感染，检测MST1对类β-细胞诱导效率及成熟的影响。体外分化得到的类β-细胞通过尾静脉注射移植到糖尿病大鼠的体内，研究在体内环境中，MST1对类β-细胞胰岛素分泌功能的调节作用及机制，结果表明：① MST1 shRNA作用后第3阶段第7天，通过细胞免疫荧光，RT-PCR和Western blot实验结果表明，胰腺祖细胞标记因子PDX1和NKX6.1开始表达，表明细胞进一步向类β-细胞分化，同时，MST1 shRNA组PDX1和NKX6.1的表达量显著高于对照组（p < 0.01），表明在类β-细胞诱导分化过程中，降低MST1的表达，可以提高PDX1和NKX6.1，对类β-细胞的产生具有促进作用；② MST1 shRNA作用后第3阶段第21天，RT-PCR和Western blot实验结果表明，MST1表达量降低，可以促进PDX1，NKX6.1，MAFA和Insulin的表达，通过流式细胞技术检测表明MST1 shRNA组细胞的NKX6.1和Insulin阳性率显著高于对照组，进一步证明MST1 shRNA可以促进类β-细胞的产生；③ 将诱导获得的类β-细胞移植到糖尿病大鼠模型体内，移植后过6周发现尾尖移植MSTI shRNA细胞的大鼠体重恢复最好，说明尾尖移植MSTI shRNA细胞具有更好的修复作用。④ 移植类β-细胞后，大鼠胰岛降糖功能得到恢复，而且MST1shRNA细胞尾尖移植后效果最好。说明在体外类β-细胞的诱导分化过程中，降低MST1的表达，可以提高类β-细胞；⑥通过免疫组织化学方法检测大鼠胰岛素表达情况。在移植6周后，移植组糖尿病大鼠胰岛形态、大小与正常相似，胰岛素分泌明显高于未移植组糖尿病大鼠。MST1shRNA细胞尾尖移植后效果最好。