茶树7-甲基黄嘌呤核苷酶基因的克隆及咖啡碱体外组合生物合成

茶树咖啡碱生物合成路径中，催化7-甲基黄嘌呤核苷反应生成7-甲基黄嘌呤的核苷水解酶的研究至今没有突破。申请项目拟采用基因差异表达的方法从茶树中克隆7-甲基黄嘌呤核苷水解酶基因并进行功能验证；利用诱导后的抗咖啡碱酵母表达载体，将克隆的7-甲基黄嘌呤核苷水解酶基因与业已发掘的咖啡碱合成酶基因在酵母中组合表达，研究从黄嘌呤核苷到咖啡碱的体外组合生物合成，通过基因差异组合对产物合成方向进行调控。7-甲基黄嘌呤核苷水解酶基因是一种DNA修复基因，对其发掘和功能验证，不仅能全面揭示咖啡碱的生物合成途径，且有助于深入理解高等植物核酸代谢和生物碱代谢之间的关系。天然低咖啡碱茶树中咖啡碱含量很低，但可可碱含量高，通过调控上游7-甲基黄嘌呤核苷水解酶基因的表达，有望实现对茶树中生物碱代谢方向的调控，研究结果将为低生物碱茶树的选育提供理论依据。咖啡碱的体外生物合成，将为规模化生产咖啡碱提供参考。

咖啡碱是存在于植物中的天然生物碱，也是茶叶中嘌呤碱的主体成分，对人体具有兴奋神经、助消化、利尿等生理作用。目前，咖啡碱作为一种重要的食品添加剂和药用原料，被广泛应用于医药、食品、化工等领域。利用基因工程，通过构建工程菌体外发酵生产咖啡碱具有广阔的应用前景。同时，在茶树咖啡碱的生物合成路径中，催化黄嘌呤核苷转化为7-甲基黄嘌呤的黄嘌呤核苷水解酶的研究至今未取得突破。本项目通过将咖啡碱生物合成中的关键酶基因咖啡黄嘌呤核苷甲基转移酶（CaXMT）和茶树咖啡碱合成酶（TCS1）分别在大肠杆菌和酿酒酵母中进行组合表达，研究从黄嘌呤核苷到咖啡碱的体外组合生物合成，尝试建立利用微生物发酵生产咖啡碱的研究平台。同时，为了进一步提高7-甲基黄嘌呤的产量从而调控咖啡碱的生物合成，我们从已建立的茶树基因组数据库中筛选克隆出黄嘌呤核苷水解酶基因并对其进行了功能验证；采用基因突变的方法筛选出了抗咖啡碱的质粒，通过分析比较找出可能影响茶树咖啡碱合成酶催化活性的关键氨基酸位点，进行定点突变来调控可可碱和咖啡碱的合成，进一步探索茶树中咖啡碱生物合成的分子调控机制。研究结果表明，将咖啡碱生物合成过程中的关键酶基因CaXMT和TCS1导入酿酒酵母中进行组合表达，在发酵产物中检测到了咖啡碱，实现了从黄嘌呤核苷到咖啡碱的生物转化；通过定点突变技术构建了茶树咖啡碱合成酶的四个突变体，且突变体TMx催化活性与野生的TCS1相比发生较大变化，其中TM1只具备N -3位甲基化活性，即只能催化7-MX合成可可碱；突变体TM2，TM3，TM4均能催化7-MX合成可可碱和咖啡碱，但催化能力有明显差异；从茶树叶片中克隆得到了茶树黄嘌呤核苷水解酶（ST3），经UPLC和LC－MS检测，结果验证了该酶具有同时催化第一步黄嘌呤核苷甲基化和第二步7-甲基黄嘌呤核苷水解反应的作用，即可以催化底物XR生成7-MX；此外，对裂殖酵母ABC（ATP-Binding Cassette）转运蛋白家族中的bfr1（brefeldin A resistance）基因进行随机突变，最终筛选出能够耐受10 mg/mL的咖啡碱突变株site-mut2，提高了酿酒酵母对咖啡碱的耐受性。以上研究结果不仅为在真核表达系统上实现规模化生物合成咖啡碱奠定了基础，还为为低生物碱茶树的选育提供理论依据，为体外规模化生产咖啡碱提供参考。