茶树精胺合成酶基因SPMS克隆及其低温胁迫响应机理研究

Since low temperature is one of the major factors affecting tea quality and production, underlying the mechanism of resisting to low temperature in tea plant (Camellia sinensis L.) warrants serious attention. Spermine,a physiologically active substance in plants, is closely related to resistance. There is no detailed report on spermine and its physiological function under cold stress in Camellia sinensis at a molecular level until now. Our previous results showed that, level of spermine content increased by cold treatment, and there is a upstream open reading frame (uORF) in the 5′ untranslated region of spermine synthase gene (SPMS), which cloned from Camellia sinensis by reverse transcript-polymerasechainreaction (RT-PCR) and rapid-amplification of cDNA ends (RACE). Based on such results, this project aims to study the spermine accumulation level and functional expression of SPMS under cold stress in tea plant. Expression level of SPMS gene in different stages in each tissures under cold stress will be investigated by real-time quantitative PCR in this project. Effect of uORF on the translation of SPMS transcript in tea plant, will be revealed by gene site directed mutagenesis technique. The interaction relationship among spermine content, SPMS gene expression and cold resistant in tea plant, will be analyzed by functional complementary experiment using Arabidopsis mutants. This project will be of critical importance to understand the cold stress related spermine in tea plant as well as expression and regulation mechanism of uORF, and provide the academic evidence for illuminating spermine and SPMS involve in cold resistance at a molecular level in tea plant.

低温是影响茶叶产量和品质的重要因素之一，茶树耐寒机理的研究具有重要意义。精胺是植物体内与抗逆性密切相关的生理活性物质，在分子水平上迄今未有精胺参与茶树抗低温的深入报道。前期发现低温环境下茶树体内精胺含量大量累积；还利用RT-PCR和RACE技术，从茶树中克隆出精胺合成酶基因（SPMS），并在其5′非翻译区发现一个具有潜在功能的上游开放阅读框（uORF）。本项目拟在已有研究基础上，将进行Real-time荧光定量PCR实验，分析在低温处理下茶树SPMS基因水平时空分布；通过拟南芥突变体基因功能互补实验，分析其精胺累积、基因表达与耐寒性之间的关系；并利用基因定点突变技术，来研究uORF对SPMS蛋白翻译过程的调控作用。本课题对认识茶树低温胁迫相关精胺含量、SPMS基因表达及其uORF之间调控机制有重要意义，为在分子水平上阐明精胺与其合成酶基因参与茶树耐寒性状机理提供理论依据。

多胺是植物体内一类生理活性物质，主要有腐胺、尸胺、亚精胺与精胺，它们与植物的抗逆性密切相关。高等植物含有的多胺主要有五种，腐胺（Put）、亚精胺（Spd）、精胺（Spm）、尸胺（Cad）和鲱精胺（Agm），且主要以游离态的形式存在，其分布具有组织和器官特异性，种类较多而且分布广泛。精胺合成酶是多胺合成途径中的关键酶，能促进精胺和亚精胺的合成，提高多胺含量，从而增强植物的耐寒性。. 本项目通过 RT-PCR（Reverse transcript-Polymerase chain reaction）和 RACE（rapid-amplification of cDNA ends）技术克隆茶树精胺合成酶基因 CsSPMS 的 cDNA 全长，并对其进行生物信息学分析和亚细胞定位，采用实时定量RT-PCR 分析其在不同茶树品种、不同组织器官以及低温胁迫处理下的表达模式，通过外源添加精胺试验验证了其对低温胁迫下茶树生理特性的证明影响，得出了精胺合成酶基因、精胺累积水平与茶树抗逆性的关系，为茶树抗逆基因工程提供候选基因资源和理论依据。.通过农杆菌介导的CsSPMS转基因拟南芥在低温条件，其脯氨酸含量始终保持高于野生型拟南芥的水平，而且上升幅度也高于野生型拟南芥；野生型拟南芥 MDA含量始终高于转基因拟南芥，且MDA含量增幅也大于转基因株系；野生型拟南芥的PSⅡ最大光化学效率Fv/Fm，潜在光化学效率Fv/Fo下降的幅度均大于转基因株系，转基因株系的qN成上升趋势，野生型株系的qN成下降趋势。以上生理指标测定结果表明目标基因过表达株系比野生型株系有更好的抗寒性效果，CsSPMS基因在拟南芥中发挥了作用，增强了植物抵抗低温的能力。. 多胺（包括腐胺、亚精胺和精胺）同时也是gamma-氨基丁酸（GABA）的前体物质，本项目对低温条件下的茶苗的GABA积累和多胺降解途径的关系进行了研究，发现在低温条件下，GABA含量、谷氨酸脱羧酶（GAD）和多胺氧化酶（PAO）活性明显增加，多胺含量大幅提高，从而为GABA形成提供了足够的基质。在此基础上，本项目研究表明GABA的累积水平是由多胺降解与谷氨酸合成共同形成的，且来自多胺降解的比例约为25 % ~ 30 %。