HBV全长转录组在慢性乙型肝炎疾病自然史中的变化规律及机制研究

A variety of mRNAs are transcribed from hepatitis B virus covalently closed circular (HBV cccDNA) including mRNA with intact sequence involved in the synthesis of virus functional protein and structural protein and spliced forms which are related to liver inflammation, degree of fibrosis and occurrence of liver cancer. In addition, HBV DNA fragments randomly integrate into host genome are also an important source of mRNA, which is one of the main reasons why HBsAg is difficult to be completely eliminated. In previous work, we found that there are significant differences in the levels of HBV mRNA in liver at different stages of the natural history of chronic hepatitis B (CHB).However, the details of HBV transcripts are not clear. In this proposal, we will use third-generation sequencing to fine mapping of the full length HBV transcriptome in natural history and directly visualize the distribution of viral transcripts in the liver using in situ nucleic acid hybridization. The role of spliced RNA in regulating viral replication and the effect of cytokines on viral transcription are determined by experiments of cell biology. The results of study are helpful to further understand the transcription process in the HBV life cycle and the pathogenesis of CHB, providing new proof for clinical diagnosis and treatment.

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA（HBV-cccDNA）转录出多种mRNA，包括序列完整的mRNA和剪接后的mRNA，前者参与病毒功能蛋白和结构蛋白的合成；后者不参与病毒复制，但与炎症、纤维化以及肝癌的发生等有关。此外，随机整合入宿主基因的HBV-DNA片段也是mRNA的重要来源，是病毒HBsAg难以彻底清除的主要原因之一。前期工作中我们发现，在慢性乙型肝炎（CHB）自然史不同时期患者肝内HBV-mRNA水平有显著差异，但目前对出现这种差异的具体细节尚不清晰。本课题中，我们将使用三代测序技术绘制自然史中HBV全长转录组的精细图谱；利用原位核酸杂交技术直接观察肝内HBV转录本的分布以及组织学特点；通过细胞实验确定剪接RNA在调节病毒复制中的作用，以及细胞因子对HBV转录的影响。研究成果有助于进一步认识和理解HBV复制周期中的转录过程和CHB致病机理，为临床诊断和治疗提供新的科学依据。

在慢性乙型肝炎（CHB）自然史不同时期患者肝内HBV-mRNA水平有显著差异，但具体细节和临床意义均尚未明确。本课题中，我们首先建立并优化了研究HBV全长转录本的生物信息学分析方法，该方法可以鉴别区分RNAintegrant和RNAcccDNA。应用建立的试验方法，进一步分析研究了慢乙肝自然史四期中HBV转录本序列分布情况，HBV-RNA剪接情况，HBsAg来源构成比（病毒转录来源/整合RNA来源）以及与疾病进展的关系。研究发现非活动携带（IC）期3.5kb mRNA明显减少，剪接体明显减少；HBV的整合明显增多；IC期即使血清中HBV-DNA病毒量较低的状态，血清中仍然有较高水平的HBsAg，说明在CHB的非活动携带者体内整合来源的HBsAg对患者疾病进展的重要性；HBV整合发生频率与年龄呈正相关趋势。这些都有助于深入认识和理解HBV复制周期中的转录过程和CHB致病机理。此外，通过原位核酸杂交技术观察并分析了自然史各期肝内病毒转录本的原位特征图谱，发现IT期的HBV-RNA阳性细胞比例最高，HBeAg阳性免疫激活期（IA）期患者包含HBV-DNA/RNA信号的细胞百分比与炎症活动呈负相关，而在HBeAg阴性IA期HBV-RNA阳性细胞与坏死炎症紧密相关，提示在此阶段病毒复制会促使慢乙肝疾病进展。该研究揭示了慢性HBV感染阶段中病毒复制的特点，进而提高了我们对慢性HBV感染的自然史和发病机制的认知，为CHB患者提供治疗起点以及治疗后疗效评估的理论依据。