圆叶葡萄MrRpv1基因抗霜霉病分子机制研究

Grape downy mildew, is an old destructive oomycete disease for viticulture. The disease is particularly serious in Guangxi with high temperature and high humidity. MrRpv1, a typical TIR-NBS-LRR gene was cloned from Chrosome 12 of M. rotundfolia using map-based cloning strategy. This is the first downy mildew resistance gene cloned from grapevine. Functions of MrRPV1 domains has been studied in our research work. However, the resistance mechanism mediated by MrRPV1 is still unknown. This project is to investigate the molecular mechanism on the basis of MrRPV1 resistance to downy mildew disease. Firstly, differentially expressed genes during the early infection will be screened by comparing the transcriptome of MrRpv1-transgenic ‘Shiraz’ (resistant) and non-transgenic ‘Shiraz’ (susceptible). In parallel with these are to identify the proteins which interacted with MrRPV1 by Y2H screening from cDNA libraries and GST pull-down combined with mass spectrometry. Secondly, protein interactions will be checked by BiFC and Co-IP. Furthermore, the function validation of candidate genes will be analyzed using gene RNAi and transient expression in grapevines. Finally, a molecular model will be built to explain the molecular mechanism of grapevine downy mildew resistance. Success of this project will not only lead to new insights into the downy mildew resistance mechanism, but also provide new candidate genes for grape molecular breeding. In conclusion, this research has important theoretical significance and application value.

葡萄霜霉病，是危害葡萄生长最严重的卵菌病害之一，在广西高温高湿的气候条件下发病尤其严重。在前期研究工作中我们利用图位克隆法在圆叶葡萄第12号染色体上克隆得到了第一个具有霜霉病抗性的TIR-NB-LRR类型的R基因MrRpv1，并明确了其结构域的功能，但该基因介导的抗性分子机制尚不清楚。本项目在此基础上，首先通过转录组测序比较转基因西拉（抗）与非转基因西拉（感）在霜霉菌侵染早期的差异表达基因；同时，利用酵母双杂交、GST pull-down结合质谱分析技术来鉴定MrRPV1的互作蛋白，再用双分子荧光互补、免疫共沉淀等技术对蛋白互作进行双重验证；最后利用基因沉默、瞬时表达等转基因手段分析这些候选基因的功能，来剖析MrRpv1介导的霜霉病抗性分子机理。本研究的完成，将不仅丰富圆叶葡萄对霜霉病抗性机制的认识，还将为葡萄分子育种提供新的目标基因，具有重要的理论意义与应用价值。

葡萄霜霉病，是危害葡萄生长最严重的卵菌病害之一，在广西高温高湿的气候条件下发病尤其严重。本项目首先通过转录组测序比较转基因西拉（抗）与非转基因西拉（感）在霜霉菌侵染早期的差异表达基因,发现，含有MrRpv1的转基因植株对霜霉菌的识别和反应更加迅速和强烈。在受到霜霉菌侵染后，MrRPV1对霜霉病的抗性起正向调节的作用。GO和KEGG富集分析发现，这些差异基因与植物免疫（包括蛋白激酶活性，磷酸转移酶活性，ATP或核苷结合，钙离子结合，脂肪酶活性）、蛋白质磷酸化和蛋白质修饰、次生代谢产物的生物合成，植物-病原体相互作用，内质网中的蛋白质加工，类黄酮生物合成，苯丙氨酸代谢，谷胱甘肽代谢和糖酵解/糖异生等途径相关。同时，利用酵母双杂交技术从霜霉菌侵染的葡萄叶片cDNA文库中筛选到与MrRPV1存在互作的蛋白DnaJ，同时我们还发现文库中的DnaJ蛋白存在不同的剪切形式，不同转录本与MrRPV1-TIR结构域和MrRPV1-LRR-C ternimal结构域之间的互作强度也有所差别，后续我们将在植物体内对这些蛋白之间的互作进行进一步的验证。而且，我们还证明了MrRPV1介导的霜霉病抗性依赖于HSP90的参与，亚细胞定位发现VvEDS1和VvPAD4，VvEDS1和VvSAG101之间存在共定位。酵母单杂交实验发现WRKY70可以与EDS1基因的启动子结合，调控EDS1的表达，HMGA和F-box protein PP2-A13可以与LOR10的启动子结合。最后，我们还通过基因组重测序，揭示了山葡萄与霜霉病抗性相关的变异，这些遗传变异影响的基因主要富集在对防御，压力和刺激的反应，倍半萜和三萜生物合成，ABC转运蛋白，和苯丙氨酸的代谢途径等生物学过程。这些发现不仅丰富圆叶葡萄对霜霉病抗性机制的认识，还为葡萄分子育种提供新的目标基因，也为进一步了解葡萄抗霜霉病的遗传机制，利用基因组标记辅助育种提供了重要的参考信息。