中国野生山葡萄VaRGA2基因抗霜霉病功能分析与调控机制研究

Grape downy mildew (DM), caused by oomycete pathogen (Plasmopara viticola Berl.), is one of the most damaging disease for economic losses worldwide. Research shows that Chinese wild grape cultures have excellent characteristics for downy mildew resistance. This study selected Vitis amurensis ‘Shuanghong’ as research material. We obtained a resistance gene analogs (VaRGA2) induced by Plasmopara viticola from resistance grape ‘Shuanghong’ based on previous data of quantitative trait locus (QTL) and transcriptome sequencing. The functional analysis of VaRGA2 will be the emphases for research and it will be preformed by subcellular localization, transcriptional activity analysis and transient transformation in grapevine. Then We will obtain ‘Thomsen seedless’ (Susceptible grape) over-expression lines to research disease resistance function by disease assays, histopathology, expression of defense-related genes, and biochemical measurement. In addition, Yeast one-hybrid and ChIP-Seq assays were used to find the upstream regulation genes and downstream target gene of VaRGA2, respectively. The candidate genes were confirmed by EMSA and Co-IP assay. In the end, we will use Crispr-cas9 to edit genome DNA of ‘Shuanghong’ in order to determine the disease resistance function of VaRGA2. This project is to provide gene resources for grape molecular breeding and to provide solid foundation for genetic improvement of grape.

葡萄霜霉病是一种广泛流行的活体专性寄生的卵菌病害，在世界范围内造成了严重的经济损失。本研究选取抗霜霉病的山葡萄‘双红’为研究材料，在课题组前期已取得抗霜霉病QTL位点的基础上，结合转录组数据筛选到一个抗病基因类似基因（VaRGA2），拟以探究其基因功能为研究中心，首先通过亚细胞定位、转录活性分析和瞬时转化葡萄叶片来探讨VaRGA2的基本抗病特征；随后通过稳定转化‘无核白’愈伤组织得到转基因葡萄植株，结合组织病理学、防御相关基因表达以及生理生化指标测定等对其抗病功能进行深入研究；接着通过酵母单杂和染色质免疫共沉淀筛选上游调控基因和下游靶基因，利用EMSA和Co-IP实验进行体外验证，明确VaRGA2基因的调控机制；最后运用CRISPR-Cas9载体，创建葡萄抗病品种DNA编辑材料，进一步研究VaRGA2基因的抗病功效。本研究将为指导和培育抗霜霉病的优良葡萄新种质、新品种提供理论基础。

葡萄霜霉病是由葡萄霜霉菌（Plasmopara viticola）引起的一种广泛流行的活体专性寄生的卵菌病害，在世界范围内造成了严重的经济损失。中国野生山葡萄‘双红’对霜霉病具有很强的抗性，研究中国野生葡萄霜霉病抗病基因功能对葡萄抗病育种具有重要的意义。本研究以具有霜霉病优良抗性的山葡萄‘双红’为研究对象，挖掘抗霜霉病关键基因并对其进行功能研究，以期为培育和指导葡萄抗霜霉病优良新种质、新品种提供理论基础。通过序列比对分析发现，VaRGA2基因全长2700bp，编码899个氨基酸，与拟南芥抗病基因AtRPP13有较高的一致性。表达模式分析显示，抗病材料山葡萄‘双红’在接种霜霉菌后VaRGA2基因的表达量显著高于对照植株；亚细胞定位分析表明VaRGA2编码蛋白定位在植物细胞的细胞质和细胞核；模式植物异源过表达表明VaRGA2基因可能通过激活SA信号途径显著地提高拟南芥转基因植株对卵菌的抗病力；VaRGA2基因瞬时转化烟草叶片结果表明基因能够增强植物对辣椒疫霉抗性。因此，VaRGA2是可能参与调控葡萄抗霜霉菌的一个正调控因子。通过酵母双杂交技术筛选得到与VaRGA2基因互作的葡萄基因GSVIVT01024605001，保守结构域分析表明含有一段DNA-binding结构域和一段HLH结构域，命名为HL1（HLH-like）基因。双分子荧光互补试验（BIFC）进一步验证了VaRGA2基因与HL1基因在细胞中相互作用。VaRGA2和HL1基因在含有GFP报告基因的烟草叶片中瞬时共表达表明HL1基因可以提高VaRGA2基因对烟草卵菌的抗病性。同时筛选得到含有mTERF保守结构域且与VaRGA2基因互作的葡萄基因，命名为ML1（mTERF-like）基因，并分析了该基因家族的生物信息学数据和响应生物胁迫的表达模式。