金龟子绿僵菌新型苯二酚内酯的生物合成及其功能研究

Fungal benzenediol lactone (BDL) polyketides，biosynthesized by modular highly reducing- and nonreducing polyketide synthases, have the anti-tumor, insecticidal bioactivities. Our study found that Metarhizium robertsii ARSEF 23 has a specific BDL biosynthetic gene cluster, in which thioesterase gene is independent on nonreducing polyketide synthase gene, salicylate hydroxylase gene is contained, and all the genes were expressed only when ARSEF 23 infected silkworm. It is not clear that what kind of product biosynthesized by this gene cluster, and whether it is involved in the infection to silkworm. In this project, we will conduct the following studies:1）combinatorial express the ARSEF23 BDL biosynthetic genes in yeast, identify the structures of combinatorial biosynthetic compounds, and elucidate the gene functions involved in BDL biosynthesis; 2)study the impacts on the abilities of ARSEF 23 infections when polyketide synthase genes, salicylate hydroxylase gene, and thioesterase gene are knocked out; 3) observe the mixed results when the mutant and wild-type strains with the heterologous combinatorial biosynthesized products are used to infect silkworm. These studies will contribute to broad the BDL biosynthetic pathway, and help to deeply understand the interaction between Metarhizium robertsii and silkworm.

真菌苯二酚内酯类聚酮化合物由一对多功能结构域组成的还原型和非还原型聚酮合酶程序化生物合成，具有抗肿瘤、杀虫和提高植物耐热的能力。本项目前期研究发现，金龟子绿僵菌ARSEF 23中的苯二酚内酯合成基因簇具有与众不同的特点：硫酯酶基因独立于非还原型聚酮合酶基因之外；含有水杨酸羟化酶；基因簇中的基因只有在感染家蚕情况下表达。该基因簇合成什么样的产物，合成的产物是否参与了绿僵菌感染家蚕的过程，目前还不清楚。本项目计划：1）在酵母中组合表达绿僵菌与苯二酚内酯合成相关的基因，确定组合生物合成产物的结构，揭示基因簇中各基因的功能；2）研究聚酮合酶基因、水杨酸羟化酶基因和硫酯酶基因的敲除对绿僵菌致病能力的影响；3）考察异源组合合成的产物与突变株和野生型菌株混合使用对家蚕致病的效果。以上研究对于发现苯二酚内酯类化合物的合成新途径并阐明其在绿僵菌侵染家蚕过程中的作用机制，具有重要的理论和应用价值。

本项目克隆了金龟子绿僵菌ARSEF 23新型苯二酚内酯合成基因簇中无内含子的还原型聚酮合酶、非还原型聚酮合酶、硫酯酶和水杨酸羟化酶的基因maRalS1、maRalS2、maTE 和maSal， 并构建了重组酵母表达质粒YEpADH2-Trp-maRalS1、YEpADH2-Ura-maRalS2、YEpADH2-Leu-maTE、YEpADH2-Leu-maSal和YEpADH2-Leu-maTE-maSal。通过在酿酒酵母中组合表达上述基因，发现当maRalS1、maRalS2和maTE共表达时，能够合成2-庚烷-4,6-二羟基苯甲酸；当maRalS1、maRalS2、maTE 和maSal共表达时，合成了不溶于甲醇、乙腈和氯仿等有机溶剂的类黑色素物质。在大肠杆菌中表达maSal并纯化蛋白，以2-庚烷-4,6-二羟基苯甲酸为底物和NADH为辅因子，确定了MaSal将底物转化为类黑色素物质，这种黑色素合成的途径不同于已报道的DHN和DOPA途径。以草铵膦抗性基因为筛选标记，通过农杆菌介导的遗传转化，筛选获得水杨酸羟化酶基因maSal和非还原型聚酮合酶基因maRalS2的突变株ΔmaSal和ΔmaRalS2，以及转录因子maTF过表达的OE::maTF菌株。和野生型相比，突变株侵染家蚕的能力降低，转录因子过表达菌株侵染能力增强。说明苯二酚内酯合成基因簇对金龟子绿僵菌ARSEF 23的侵染能力有影响。本研究发现了以苯二酚内酯合成基因为基础的真菌新型类黑色素合成途径，探讨了其生物合成机制，研究了该合成途径对侵染昆虫的影响。研究结果有助于了解多样性真菌聚酮化合物的生物合成机制及生物学功能。